細胞培養(yǎng)基的基本要求

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   體外培養(yǎng)的細胞直接生活在培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基應(yīng)能滿足細胞對營養(yǎng)成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。

營養(yǎng)成分：

1. 氨基酸：所有細胞都需要12種必須氨基酸：纈、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精、胱氨酸。
2. 單糖：六碳糖是主要能源，也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細胞對葡萄糖的吸收能力zui高，半乳糖zui低。 體外培養(yǎng)動物細胞時，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。
3. 維生素：生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。
4. -無機離子與微量元素：細胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。
5. 促生長因子及激素：o各種激素、生長因子對于維持細胞的功能、保持細胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對許多細胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細胞有明顯促進作用。
6. 滲透壓 ：8 r. s%細胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養(yǎng)人體細胞的理想滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數(shù)哺乳動物細胞，滲透壓在260～320mOsm/kg的范圍都適宜。
7. pH、氣體：是細胞生存的必需條件之一，所需氣體主要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細胞生長、增殖和合成各種成分。一些細胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數(shù)細胞缺氧不能生存。在開放培養(yǎng)時，一般置細胞于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。二氧化碳既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞所需成分，它主要與維持培養(yǎng)基的pH有直接關(guān)系。動物細胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件，pH值約在7.2～7.4，在細胞生長過程中，隨細胞數(shù)量的增多和代謝活動的加強，二氧化碳不斷被釋放，培養(yǎng)液變酸，pH值發(fā)生變化。由于NaHCO₃容易分解為二氧化碳，很不穩(wěn)定，致使緩沖系統(tǒng)難以地控制。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng)。HEPES結(jié)合碳酸氫鈉使用，可提供更有效的緩沖體系，主要是防止pH值迅速變動，但zui大缺點是在開放培養(yǎng)或觀察時難以維持正常的pH值。造成pH波動主要是代謝產(chǎn)生的CO₂，在封閉式培養(yǎng)過程中CO₂與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。為解決這一問題，合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO₃-CO₂緩沖系統(tǒng)，并采用開放培養(yǎng)，使細胞代謝產(chǎn)生的CO₂及時溢出培養(yǎng)瓶，再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO₂濃度（5％），與培養(yǎng)基中的NaHCO₃處于平衡狀態(tài)。
8. 無毒、無污染：體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有抵抗能力，因此培養(yǎng)基應(yīng)達到無化學(xué)物質(zhì)污染、無微生物污染（如細菌、真菌、支原體、病毒等）、無其他對細胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補體）。對于天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應(yīng)當嚴格選材，嚴格操作。對于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿應(yīng)十分潔凈，配制后應(yīng)嚴格過濾除菌。

細胞培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基：使用zui普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清zui普遍。血清由于含有多種細胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質(zhì)。與合成培養(yǎng)基合用，能使細胞順利增殖生長。

合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞所需物質(zhì)的種類和數(shù)量嚴格配制而成的。內(nèi)含碳水化合物、氨基酸、脂類、無機鹽、維生素、微量無素和細胞生長因子等。單獨使用細胞雖有生存但不能很好的生長增殖。

血清種類

目前用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養(yǎng)細胞的原因：來源充足、制備技術(shù)成熟、經(jīng)過長時間的應(yīng)用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清對絕大多數(shù)哺乳動物細胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細胞時使用其他動物血清更合適。

牛血清是細胞培養(yǎng)中用量zui大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)zui高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分zui少。

血清的主要成分

血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復(fù)雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質(zhì)對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。

血清主要作用

1. 提供基本營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、無機物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等，是細胞生長必須的物質(zhì)。

2. 提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。

3. 提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。

4. 提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。

5. 對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用：有一些細胞，如內(nèi)皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經(jīng)被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。

血清培養(yǎng)基主要問題

1. 血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準確的成份、含量及其作用機制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識，這給研究工作帶來許多困難。

 2. 血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實驗的標準化和連續(xù)性受到限制。

3. 對大多數(shù)細胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進某些細胞的生長（成纖維細胞）同時抑制另一類細胞生長（表皮細胞）。

4. 血清含一些對細胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應(yīng)（如精胺、亞精胺）形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡。

5. 動物個體不同，血清產(chǎn)地、批號不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致。

6. 取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產(chǎn)生潛在影響，可能導(dǎo)致實驗失敗或?qū)嶒灲Y(jié)果不可靠性。

7. 大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構(gòu)成動物細胞培養(yǎng)對生產(chǎn)成本的主要部分之一。

血清的質(zhì)量標準

血清質(zhì)量高低取決于兩方面因素：一是取材對象，二是取材過程。用于取材的動物應(yīng)健康無病并且在的出生天數(shù)之內(nèi)，取材過程應(yīng)嚴格按照操作規(guī)程執(zhí)行，制備出的血清要經(jīng)過嚴格的質(zhì)量鑒定。WHO公布的《用動物細胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求：

1. 牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應(yīng)具備適當?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng)。

2. 有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。

3. 證明所用牛血清中不含對所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。

4. 血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。

5. 無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細菌噬菌體污染。

6. 對細胞有良好的支持繁殖作用。

我國在對牛血清的質(zhì)量2000年版《中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標準》中提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質(zhì)含量，細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內(nèi)毒素等。

血清質(zhì)量的鑒定

1. 理化性質(zhì)：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應(yīng)小于20g/L)、血紅蛋白含量等。

其中球蛋白含量是一項非常重要的指標，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。血紅蛋白也是越低越好。

2. 微生物檢測：包括細菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測，支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑22u的濾膜。支原體、病毒污染在光學(xué)顯微鏡下難于察覺，細胞也能生長繁殖，但會影響實驗結(jié)果。檢測支原體的方法很多，如培養(yǎng)法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。

3. 促生長效果：這是血清重要的特性之一，應(yīng)當以培養(yǎng)的細胞來檢測。有以下方法：克隆形成率、貼瓶率測定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)法。

（1） 克隆形成率測定:一般以懸浮生長的細胞為培養(yǎng)對象，按有限稀釋法做克隆化培養(yǎng)，將不同批號的血清配制成不同濃度的培養(yǎng)基，細胞也稀釋成不同濃度，接種到96孔板，每孔200ul，培養(yǎng)一定時間，統(tǒng)計有克隆生長的孔，計算出百分比，再與對照的標準血清相比較，就可看出不同批號血清間的區(qū)別。比較低的濃度，更能觀察出血清質(zhì)量間的細微差別。

（2） 貼瓶率測定:是以貼壁細胞為培養(yǎng)對象，將細胞稀釋至低密度，接種至平皿，每皿200或100個細胞，以不同濃度的血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時間后棄培養(yǎng)基，染色后統(tǒng)計集落數(shù)，計算出集落數(shù)占接種細胞數(shù)的百分比，同樣再與標準血清比較，判斷血清質(zhì)量高低。

（3） 連續(xù)傳代培養(yǎng)法:是將細胞培養(yǎng)于3個一定體積的培養(yǎng)瓶中，待測血清配制為5％濃度，一般于第七天收集細胞，計數(shù)，取平均值，中間可以更換一次培養(yǎng)基。連續(xù)測試三個周期以上，觀察細胞生長狀況，并將每次的計數(shù)結(jié)果與標準血清的測試結(jié)果比較。

4. 對于使用者，判斷血清質(zhì)量先從外觀入手。好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如發(fā)現(xiàn)血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性；若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時有溶血現(xiàn)象；如果搖晃時感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。如果要進一步了解血清的質(zhì)量，則應(yīng)連續(xù)培養(yǎng)某些細胞，觀察細胞生長狀況。

血清的使用與儲存：

正確的使用及保存血清，才能使血清發(fā)揮應(yīng)有的作用。

1. 使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的是去除血清中的補體成分，避免補體對細胞產(chǎn)生毒性作用。血清經(jīng)過滅活也會損失一些對細胞有利的成分，如生長因子，因此也有人提出血清不經(jīng)滅活直接用于培養(yǎng)，這樣做的前提是確認血清中不含補體成分。對于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細胞培養(yǎng)。

2. 儲存條件：血清一般儲存于－20℃，同時應(yīng)避免反復(fù)凍融。購買大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于－20℃，使用前融化。融化時置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長時間存放，應(yīng)盡快使用。

3. 使用濃度：自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5－20％，zui常用是10％。過多血清容易使培養(yǎng)中的細胞發(fā)生變化，特別是一些二倍體的無限細胞系，迅速生長之后容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。

采購血清時，先從供應(yīng)商處索取樣品進行試驗，選定一批后就要保留足夠使用6個月至1年的量，直至用另一批經(jīng)過預(yù)先試驗的樣品代替。

合成細胞培養(yǎng)基

   合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成、人工設(shè)計、配制的培養(yǎng)基。它有一定的配方，是一種理想的培養(yǎng)基。目前合成培養(yǎng)基多達10多余種，有的培養(yǎng)基仍在不斷進行改良。早期組織培養(yǎng)是利用天然培養(yǎng)基，目前合成培養(yǎng)基已經(jīng)成為一種標準化的商品，從zui初的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基，并且還在不斷發(fā)展。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)極大的促進了組織培養(yǎng)技術(shù)的普及發(fā)展。

基本組分

1. 無機鹽：CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。對調(diào)節(jié)細胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。

2. 氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它們都是細胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成。除此之外，還需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，對細胞的培養(yǎng)特別重要，能促進各種氨基酸進入細胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來源，還是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏可導(dǎo)致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)補加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中單獨配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液中。

3. 維生素：是維持細胞生長的一種生物活性物質(zhì)，在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對細胞代謝有重大影響。脂溶性維生素(A、D、E、K)常從血清中得到補充。水溶性維生素包括生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。維生素C也是*的，對具有合成膠原能力的細胞更為重要。

4. 碳水化合物：是細胞生命的能量來源，有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。體外培養(yǎng)動物細胞時，幾乎所有培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。

5. 葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用：乳酸是葡萄糖不*氧化的產(chǎn)物。體外培養(yǎng)條件下95％的葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，這降低了營養(yǎng)物質(zhì)的代謝效率，降低培養(yǎng)基pH值，增加滲透壓。在氧氣供給不足的情況下，NADH轉(zhuǎn)運系統(tǒng)蘋果酸－天冬氨酸穿梭系統(tǒng)活性低而不能將糖酵解產(chǎn)生的NADH氧化磷酸化為NAD+，細胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脫氫酶將糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸與NADH反應(yīng)生產(chǎn)乳酸和NAD+，從而保證了糖酵解的順利進行。另一個可能的解釋是連接糖酵解與TCA循環(huán)的特異性酶如丙酮酸脫氫酶復(fù)合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下，直接導(dǎo)致糖酵解與TCA循環(huán)的失衡。因此體外培養(yǎng)條件下，葡萄糖主要經(jīng)糖酵解降解，產(chǎn)生過量的乳酸。減少乳酸生產(chǎn)zui常用的方法是限制培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量過低可造成細胞營養(yǎng)供應(yīng)不足，細胞生長抑制。該方法需要對葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產(chǎn)速率以及目的蛋白的表達量等參數(shù)進行綜合考慮方可應(yīng)用。

在目前常用的培養(yǎng)基中，葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養(yǎng)動物細胞的主要能源，其能量代謝通路與體內(nèi)*不同，表現(xiàn)為葡萄糖主要經(jīng)糖酵解途徑為細胞提供能量，谷胺酰胺大部分通過不*氧化途徑，另一小部分通過*氧化為細胞供能。因此，適當?shù)恼{(diào)整細胞內(nèi)的代謝途徑，使之能促進細胞的快速生長和產(chǎn)物合成，同時減少代謝抑制物的生成是行之有效的一種策略。

許多動物細胞如CHO、BHK和雜交瘤細胞對營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而對于細胞生長而言，二者的快速利用并非細胞必需；相反相當一部分轉(zhuǎn)化為代謝廢物乳酸和氨，以及一些非必需氨基酸如丙氨酸，脯氨酸。其中，乳酸和氨是兩種主要代謝廢物，其積累可影響細胞生長以及產(chǎn)品質(zhì)量。減少這兩種代謝產(chǎn)物的積累，是大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術(shù)研究的重要方向。

氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺產(chǎn)生的。限制培養(yǎng)基中谷氨酰胺的含量亦是減少氨生成的常用方法。

6. 除了以上與細胞生長有關(guān)的物質(zhì)以外，培養(yǎng)基中一般還要加入酚紅（當溶液酸性時pH小于6.8呈黃色；當溶液堿性時pH大于8.4呈紅色），一種pH指示劑。

7. 在較為復(fù)雜的培養(yǎng)液中還包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶兩類)以及氧化還原劑(如谷胱甘肽)等。有的培養(yǎng)液還直接采用了三磷酸腺苷和輔酶A。

無血清培養(yǎng)基

無血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM)：是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的*培養(yǎng)基可以滿足大部分細胞培養(yǎng)的要求，但對有些實驗卻不適合，如觀察一種生長因子對某種細胞的作用，這時需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。

無血清培養(yǎng)基的基本配方:基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。 用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細胞在體外培養(yǎng)時，多數(shù)呈貼壁生長或兼性貼壁生長；而當其在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中生長時，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細胞往往以懸浮形式生長。

添加組分促貼壁物質(zhì)：許多細胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴展因子，一般為細胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進來自中胚層細胞的貼壁與分化，這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質(zhì)細胞、CHO細胞、成肌細胞等

2. 促生長因子及激素：針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細胞*的，如胰島素。

3. 酶抑制劑：培養(yǎng)貼壁生長的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中*須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。zui常用的是大豆胰酶抑制劑。

4. 結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白：常見如轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護細胞免受機械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。

5. 微量元素：硒是zui常見的。

使用方法

目前，血清仍是動物細胞培養(yǎng)中zui基本的的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細胞生長狀況不良時，常常會先使用有血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，待細胞生長旺盛以后，再換成無血清培養(yǎng)液。細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個適應(yīng)過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細胞死亡，存活細胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前，要留有種子細胞，種子細胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細胞的特性不發(fā)生變化。

為了使細胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)，關(guān)鍵的是使所培養(yǎng)細胞：

1. 處于對數(shù)生長中期

2  活細胞率

3. 適應(yīng)時以較高的起始細胞接種

細胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的方法

1.直接適應(yīng)：細胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中。

 一些類型細胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無血清培養(yǎng)基。對于直接適應(yīng)，接種細胞密度應(yīng)該:2.5×10⁵～3.5×10⁵細胞/ml。細胞密度達到1×10⁶～3×10⁶細胞/ml時，傳代培養(yǎng)細胞。細胞密度在培養(yǎng)4到7天后達到2×10⁶～4×10⁶細胞/ml時，細胞*適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基。

細胞密度達到1×10⁶～3×10⁶細胞/ml，細胞活率在90％時，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

連續(xù)適應(yīng)：分好幾步把細胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中，與直接適應(yīng)相比較，連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩毎訙睾鸵恍?/span>

 以2倍正常接種密度接種生長活躍的細胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基：25％SFM 混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。

 當細胞密度>5×10⁵細胞/ml時，以2×10⁵到3×10⁵細胞/ml細胞密度，在有血清培養(yǎng)基：SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

 以2×10⁵到3×10⁵細胞/ml細胞密度，25％有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng)。

 當細胞密度達到1×10⁶到3×10⁶細胞/ml（接種后4到6天），在100％SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

 每隔3到5天，當細胞密度達到1×10⁶到3×10⁶細胞/ml，細胞活率在90％時，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前，需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進行幾次傳代。

在適應(yīng)過程中，不要讓細胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。

細胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清：

許多細胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng)，用包含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1（v∶v）的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。通過下列的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)幾代減少當前培養(yǎng)基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時，傳代細胞2到3次。

培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長的延遲可能會發(fā)生，進行2到3次的傳代，使生長率恢復(fù)到以前的水平。

特別需要強調(diào)的是：配制無血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對細胞產(chǎn)生致死性損害。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。

無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點

1. 可避免血清批次間的質(zhì)量變動，提高細胞培養(yǎng)和實驗結(jié)果的重復(fù)性。

2. 避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染。

3. 避免血清組分對實驗研究的影響。

4. 有利于體外培養(yǎng)細胞的分化。

5. 可提高產(chǎn)品的表達水平并使細胞產(chǎn)品易于純化。

缺點：

 1. 細胞在無血清培養(yǎng)基中易受某些機械因素和化學(xué)因素的影響，培養(yǎng)基的保存和應(yīng)用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便。

2. 成本較高。

3. 針對性很強，一種無血清培養(yǎng)基僅適合某一類細胞的培養(yǎng)。

無蛋白培養(yǎng)基與限定化學(xué)成分培養(yǎng)基

無蛋白培養(yǎng)基（protein free midium,PFM）:即不含有動物蛋白的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基仍含有較多的動物蛋白，如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術(shù)發(fā)展的趨勢來看，不含動物蛋白的培養(yǎng)基有廣泛的應(yīng)用前景，許多利用基因工程技術(shù)重組的蛋白質(zhì)zui終要應(yīng)用于人體，如果再生長過程中使用了含有動物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，純化過程就比較復(fù)雜，zui終要達到一定的質(zhì)量標準也有一定的難度。無蛋白培養(yǎng)基就是為了適應(yīng)這發(fā)展趨勢而出現(xiàn)的，許多無蛋白培養(yǎng)基添加了植物水解物以替代動物激素、生長因子的作用。市場上已有適合多種細胞生長的無蛋白培養(yǎng)基。

限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(chemical defined medium,CDM)：是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有動物蛋白，同樣也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細胞的分泌產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于293細胞、CHO細胞、雜交瘤細胞生長的CDM問世。

常用細胞培養(yǎng)基

1. MEM細胞培養(yǎng)基系列
2. DMEM細胞培養(yǎng)基系列
3. RPMI-1640細胞培養(yǎng)基系列
4. 199細胞培養(yǎng)基系列
5. 水解乳蛋白細胞培養(yǎng)基
6. 歐氏平衡鹽
7.細胞培養(yǎng)基系列
8. 其它類型細胞培養(yǎng)基

干粉培養(yǎng)基的配制

注意事項

1. 認真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實驗需要決定。

2. 配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基*溶解之后才能添加。

3. 配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。

4. 所用器皿應(yīng)嚴格消毒。

5. 配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾，無菌保存于4度。

6. 液體培養(yǎng)基主要是為了科研工作的方便而設(shè)計的培養(yǎng)基，它是一種滅菌后保證無菌的溶液，必要時可制成無內(nèi)毒素等的溶液，可節(jié)省科研人員的工作量。

配制方法

1. 在一個盡可能接近總體積的容器中加入比預(yù)期培養(yǎng)基總體積少5％的雙蒸水。

2. 在室溫（20℃到30℃）的水中加入干粉培養(yǎng)基，輕輕攪拌，不要加熱。

3. 水洗包裝袋的內(nèi)部，轉(zhuǎn)移全部的痕量干粉到容器內(nèi)。

4. 加NaHCO3到培養(yǎng)基中。

5. 用雙蒸水稀釋到想要的體積，攪拌溶解。注意不要過分攪拌。

6. 通過緩慢攪拌加入1N NaOH 或1N HCL調(diào)節(jié)pH值，由于pH值在過濾時會上升0.1到0.3，因而調(diào)節(jié)pH值使它比zui終想要的pH值低0.2到0.3。培養(yǎng)基在過濾前要保持密封。

細胞培養(yǎng)基的保存

1. 干粉，買了后一定要保存在4度。有人保存在－20度，沒有必要。但4度是非常必要的。保證期是有提示的。
2. 配好的無血清培養(yǎng)基一定保存在4度，保存不要超過3個月。用時根據(jù)提示要加入谷胺酰胺。
3. 加入血清的培養(yǎng)基，保存在4度不要超過1個月，時間太長，活性下降。當然稍微長點也不一定出問題。但是根據(jù)細胞而定；如果原代培養(yǎng)，新鮮，如果是腫瘤細胞，或僅維持傳代就不太要緊。但是原則是越新越好。

細胞培養(yǎng)基的選擇

1. 建立某種細胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細胞的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I，或在購買細胞株時咨詢。

2. 其它實驗室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細胞。

3. 根據(jù)細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細胞株多選 RPMI1640 。

4. 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇*培養(yǎng)基，這是zui客觀的方法，但比較繁瑣。

不同細胞系適用的培養(yǎng)基表% N) E7 w( N! Y6 p9 r