牛血清白蛋白的

提取與鑒定

• 實驗名稱    牛血清白蛋白的提取與鑒定
• 實驗?zāi)康?nbsp;   
• 1、掌握鹽析法提取牛血清白蛋白                        2、掌握血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定牛血清白蛋白 3、了解用溴甲酚綠鑒定血清蛋白
• 實驗原理    1，蛋白質(zhì)是水化作用較強的高分子物質(zhì)，向其加入堿土金屬的中性鹽類可是蛋白質(zhì)膠粒脫水并失去電荷，從溶液中沉淀出來。球蛋白在半飽和的硫酸銨溶液中可析出，而清蛋白則需在飽和的硫酸銨溶液中可析出?？蓪⒀逯邪椎鞍着c其它球蛋白分離，zui后用透析法除鹽，即可提取白蛋白。2，利用電泳過程中帶電粒子的移動速度與粒子荷電量、電場強度、粒子重量與半徑及介質(zhì)的黏稠度等有關(guān)，可對牛血清白蛋白進行分離與鑒定。3，血清中的白蛋白與溴甲酚綠在ph=4.2的條件下結(jié)合生成綠色化合物，溶液由黃色變?yōu)榫G色，而球蛋白基本不與之反應(yīng)，縮短反應(yīng)時間可去除干擾，其顏色的深淺與白蛋白濃度成正比，可用于鑒定牛血清白蛋白。

• 實驗步驟    

（一）鹽析    取離心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋血清，搖勻后，逐滴加入pH7.2飽和硫酸銨溶液2mL，邊加邊搖，充分混勻，然后靜止放置10分鐘，再離心（4000r/min）10min，將上清液傾入試管中。

（二）透析    取玻璃紙一張，折成袋形，將離心后的上清液倒入袋內(nèi)，用線扎緊上口（注意要留有空隙），用玻璃棒懸在盛有半杯蒸餾水的100mL燒杯內(nèi)，使透析袋下半部侵入水中，對蛋白液進行透析，常用玻璃棒攪拌袋外（燒杯中）液體，以縮短透析時間。更換蒸餾水多次，用納氏試劑檢查袋外液體的NH₄⁺，觀察顏色變化，直至袋內(nèi)鹽分透析完畢。將袋內(nèi)液體傾入試管，即得牛血清白蛋白溶液。

（三）BCG法鑒定  

 白蛋白+溴甲酚綠     ph=4.2    綠色復(fù)合物

或（三）電泳鑒定

（1）點樣    取一張膜條，將薄膜無光澤面向下，放入培養(yǎng)皿中的巴比妥緩沖液中使膜條充分浸透，取出，用干凈濾紙吸去多余的緩沖液，以薄膜的無光澤面距一端1.5㎝處作點樣線，將牛血清樣品與待測的牛血清白蛋白溶液分別用點樣器在同一張薄膜的點樣線處不同位置點樣。

（2）電泳    將點樣后的膜條置于電泳槽架上，放置時膜條無光澤面向下，點樣端置于陰極，待平衡5min后，打開電源，調(diào)節(jié)電泳儀的電壓為160伏，通電60min，關(guān)閉電源后用鑷子將膜條取出。

（3）染色    將膜條直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染2分鐘取出，立即浸于漂洗液中，分別在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5min，直至背景漂洗干凈為止，用濾紙吸干薄膜。

（4）鑒定    比較樣品與待測液中白蛋白在薄膜上的電泳結(jié)果，看位置是否一致。

• 實驗儀器和試劑

儀器：離心管、離心機、試管、玻璃紙、燒杯、比色磁盤、滴管、玻璃棒、電泳儀、醋酸纖維素薄膜、分光光度計。

試劑：牛血清待測液、牛血清樣品、PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水，用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）配制的0.9%NaCl溶液）、pH為7.2的飽和硫酸銨溶液、溴甲酚綠、納氏試劑、巴比妥緩沖液、氨基黑10B染色液、漂洗液、0.4N氫氧化鈉溶液。

• 預(yù)測結(jié)果    透析后牛血清白蛋白溶液與溴甲酚綠反應(yīng)溶液由黃色變?yōu)榫G色。 或  電泳后位置一致，則實驗成功。若在待測液的電泳結(jié)果中出現(xiàn)其他球蛋白的黑帶區(qū)域，則說明提取不夠純。