動物細胞培養(yǎng)  細胞傳代培養(yǎng)

【實驗目的】

熟練掌握細胞的傳代培養(yǎng)法。

【實驗原理】

傳代培養(yǎng)是組織培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一。也是幾乎所有細胞生物學實驗的基礎。當細胞在培養(yǎng)瓶中長滿后就需要將其稀釋分種成多瓶，細胞才能繼續(xù)生長。這一過程就叫傳代。傳代培養(yǎng)可獲得大量細胞供實驗所需。傳代要在嚴格的無菌條件下進行，每一步都需要認真仔細的無菌操作。

【材料用品】

材料：培養(yǎng)瓶，試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，75％酒精棉球，酒精燈，培養(yǎng)細胞。

藥品：培養(yǎng)基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25％胰蛋白酶，Hanks液。

儀器：C02培養(yǎng)箱，倒置：顯微鏡，超凈臺。

【實驗步驟】

1．人無菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒雙手。

2．倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要傳代及細胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)用液置37℃下預熱。

3．超凈臺臺面應整潔，用0.1％新潔爾滅溶液擦凈。

4．打開超凈臺的紫外燈照射臺面20 min左右，關閉超凈臺的紫外燈，打開抽風機清潔空氣，除去臭氧。

5．點燃酒精燈；取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮頭；過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內(nèi)。

6．將培養(yǎng)用液瓶口用75％酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。

7．倒掉培養(yǎng)細胞的舊培養(yǎng)基。酌情可用2—3 mL Hanks液洗去殘留的舊培養(yǎng)基，或用少量胰酶涮洗一下。

8．每個大培養(yǎng)瓶加入1 mL胰酶，小瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當細胞收回突起變圓時立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉。注意勿使細胞提早脫落入消化液中。

9．加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復吹打消化好的細胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基(7～10 mL／大瓶，3～5 mL／小瓶)制成細胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋，適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn)，以利于CO2氣體的進入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。

10．對懸浮培養(yǎng)細胞，步驟7-9不做。可將細胞懸液進行離心去除舊培養(yǎng)基上清，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。

【注意事項】

1．傳代培養(yǎng)時要注意無菌操作并防止細胞之間的交叉污染。所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。每次只進行一種細胞的操作。每一種細胞使用一套器材。培養(yǎng)用液應嚴格分開。

2．每天觀察細胞形態(tài)，掌握好細胞是否健康的標準：健康細胞的形態(tài)飽滿，折光性好，生長致密時即可傳代。

3．如發(fā)現(xiàn)細胞有污染跡象，應立即采取措施，一般應棄置污染的細胞，如果必須挽救，可加含有抗生素的BSS或培養(yǎng)基反復清洗，隨后培養(yǎng)基中加入較大量的抗菌素，并經(jīng)常更換培養(yǎng)基等。