細(xì)胞培養(yǎng)注意事項

培養(yǎng)室內(nèi)的無菌操作

細(xì)胞培養(yǎng)實驗所需的物品、器材應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌或購買無菌的一次性物品。玻璃瓶可擰松瓶蓋滅菌（指高壓蒸汽滅菌，以下同）或用鋁箔紙包住瓶口，和瓶蓋分別滅菌。其它玻璃和金屬器材用鋁箔紙包裹進(jìn)行滅菌。玻璃吸管應(yīng)塞上棉花球滅菌，然后置于烘箱中烘干。不適于進(jìn)行高壓滅菌的瓶塞等其它物品，可浸泡在70%酒精中進(jìn)行滅菌，然后在超凈工作臺上吹干。細(xì)胞培養(yǎng)液和其它不適于高壓滅菌的溶液，應(yīng)通過過濾（采用0.22μm的孔徑的濾膜）滅菌。無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖地面一次，并用紫外線照射滅菌30分鐘。超凈工作臺每次使用前用70%酒精擦拭，然后紫外線照射30分鐘。

進(jìn)入無菌操作室要求穿著無菌工作服、工作帽、口罩。開始工作前用70%酒精對手、前臂及乳膠手套進(jìn)行消毒。細(xì)胞培養(yǎng)等操作應(yīng)在超凈工作臺或有空氣過濾器的空間內(nèi)進(jìn)行。操作前點燃酒精燈，細(xì)胞培養(yǎng)的所有操作，如打開或關(guān)上試管或培養(yǎng)瓶蓋等，都要靠近酒精燈并經(jīng)過短時間的灼燒。燒過的實驗器械，冷卻后才能使用。已吸過培養(yǎng)液或其它有機(jī)液體的吸管不得再用火焰燒灼。不同液體分別用不同的吸管吸取，不能混用。開蓋后的培養(yǎng)瓶盡量避免垂直放置，同時瓶蓋應(yīng)扣放在超凈工作臺上，以減少落入細(xì)菌的機(jī)會。細(xì)胞培養(yǎng)物在處理和使用前，不要過早暴露于空氣中。在進(jìn)行轉(zhuǎn)移液體操作時，移液器不能觸及瓶口以避免細(xì)菌污染或交叉污染。放置吸管時管口向下傾斜，以防止液體倒流引起污染。培養(yǎng)細(xì)胞的廢棄用品，應(yīng)放入可封裝的容器內(nèi)。

細(xì)胞培養(yǎng)樣品的采集

器材與試劑：1.眼科剪，彎鑷子、手術(shù)刀；2.裝有無血清培養(yǎng)液或PBS（KCl,2.7mM;KH₂PO₄,1.5mM;NaCl 136.9mM;Na₂HPO₄, 8.1mM）的小瓶； 3.10ml、50ml小燒杯；4. 培養(yǎng)皿。

操作步驟：

1. 采樣時應(yīng)嚴(yán)格無菌操作。采樣時應(yīng)用已滅菌的器械、無菌包裝的器皿和經(jīng)過濾滅菌的緩沖溶液和培養(yǎng)液。采樣過程中盡量避免紫外線照射和接觸對細(xì)胞有毒害作用的化學(xué)試劑。在有污染因素存在的區(qū)域采樣時，應(yīng)將樣品在含有500-1000U/ml的青、鏈霉素的PBS中漂洗3次，每次1-2分鐘。
2. 在條件允許的情況下，宜采細(xì)胞易存活、增殖速度快的胚胎組織。
3. 采樣時應(yīng)用鋒利的器械切碎組織，盡可能減少對細(xì)胞的機(jī)械損傷。
4. 采樣時應(yīng)切除采樣組織外的其它成份，如附著在采樣組織上的血液、脂肪、神經(jīng)組織、結(jié)締組織和壞死組織。修剪和切碎過程中，應(yīng)將樣品浸泡于少量培養(yǎng)液中，以避免組織干燥。
5. 采取的樣品應(yīng)盡快培養(yǎng)。因故不能立即培養(yǎng)時，應(yīng)將樣品切成1cm³以下的小塊，浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)，置于冰浴或4℃冰箱中。時間不能超過2小時。
6. 采樣的同時要留好組織學(xué)標(biāo)本和電鏡標(biāo)本，以便于以后鑒別原代組織的來源和觀察細(xì)胞體外培養(yǎng)后與原組織的差異性。對樣品的來源、供體的一般情況（包括性別、年齡、健康狀況等）要做詳細(xì)的記錄以備查詢。

細(xì)胞的原代培養(yǎng)

器材與試劑：1.離心機(jī)，眼科剪，牙科探針;2.培養(yǎng)瓶（皿），吸管，小燒杯；3.PBS緩沖液，細(xì)胞培養(yǎng)液。

操作步驟：

1. 對于樣品量較少的組織，采用組織塊培養(yǎng)法。

即將組織剪成小塊后接種于培養(yǎng)瓶（皿）。具體操作規(guī)程如下：

1. 將樣品切成1mm³左右的小塊。在剪切過程中，向樣品滴加少量培養(yǎng)液，以保持樣品濕潤。
2. 將剪切好的組織小塊，用眼科鑷子送入培養(yǎng)瓶（皿）內(nèi)，用牙科探針或彎頭鑷子將組織塊在瓶壁上均勻擺置，小塊間距0.5cm左右。輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓放置樣品的瓶壁朝上，向瓶內(nèi)注入適量培養(yǎng)液，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶傾斜放置入二氧化碳培養(yǎng)箱中。
3. 放置3小時后，待組織小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，擰松瓶蓋，靜置培養(yǎng)。原代培養(yǎng)第4天時換液一次。

2 對大量樣品的培養(yǎng)，宜采用組織分離的方法培養(yǎng)。

2.1組織的分離

2.1.2 培養(yǎng)材料為血液、羊水、胸水和腹水等細(xì)胞懸液時，采用離心法分離。用小型臺式離心機(jī)1000 rpm（約110-120G的離心力）離心5分鐘（以下離心條件同），去除上清液。

2.1.3 對一些纖維成份很少的組織（如腦組織、部分胚胎組織以及一些腫瘤組織）進(jìn)行分離處理時，在細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)用剪刀剪切后用吸管反復(fù)吹打分散細(xì)胞；或?qū)悠窋D壓通過不銹鋼網(wǎng)(孔徑在80目以上)的方法進(jìn)行分離。離心過濾液，收集細(xì)胞。去除上清液。

2.1.4 對于不適于上述兩種方法分離的樣品，采用消化分離方法，即將剪切成較小體積的組織塊通過胰蛋白酶或膠原酶消化進(jìn)行進(jìn)一步的分散。對細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝、腎等組織宜使用胰蛋白酶。在進(jìn)行消化時，用0.25%的胰蛋白酶，pH8的條件下在37℃消化20分鐘。對胰蛋白酶耐受性差的樣品，消化期間應(yīng)通過顯微鏡隨時觀察消化情況，采用分次消化，及時把已消化分離下來的細(xì)胞與組織分開，放入含有血清的培養(yǎng)液中，更換消化液后再繼續(xù)消化。對于纖維性組織、上皮及癌組織宜使用膠原酶進(jìn)行消化分離。消化時采用0.2μg/ml的膠原酶溶液37℃條件下消化4-48小時，可根據(jù)細(xì)胞分散的程度而定。在消化分離法中，隨時吸取少量消化液在顯微鏡下觀察，如發(fā)現(xiàn)組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個細(xì)胞，則終止消化。通過孔徑適當(dāng)?shù)暮Y網(wǎng)，濾掉未消化的樣品塊。已過濾的消化液1000 rpm離心5分鐘，去除上清，加含10%血清的培養(yǎng)液，輕輕吹打形成細(xì)胞懸浮液，再次離心，去除上清液。

2.2 加入含20%血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，輕輕吸打離心后收集到的細(xì)胞，使之分散均勻。進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，然后接種到含20%血清的細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶（皿）中，松松蓋上瓶蓋，放入二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.3原代培養(yǎng)第4天時換液一次。

2.4對細(xì)胞原代培養(yǎng)所用試劑和主要參數(shù)進(jìn)行記錄（見附表1）

傳代培養(yǎng)

器材與試劑：1.離心機(jī)、滴管、離心管、培養(yǎng)瓶（培養(yǎng)皿）、計數(shù)板;2.0.05% ～ 0.25% 胰蛋白酶消化液(溶液中含0.05% ～0.25%的胰蛋白酶,其它成份與PBS同)，細(xì)胞培養(yǎng)液^*，PBS緩沖液。

* 根據(jù)細(xì)胞種類不同選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)液。各主要類型的細(xì)胞培基（液）都已商品化，可在國內(nèi)外生物制劑公司買到。有時需在商品化的細(xì)胞培基（液）中加入一些其它營養(yǎng)物質(zhì)或生長因子以滿足一些特殊細(xì)胞種類的生長需要。

操作步驟：

1．貼壁生長的細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

1.1 當(dāng)原代培養(yǎng)后的細(xì)胞增殖至整個瓶（皿）壁被細(xì)胞覆蓋時（貼壁生長的細(xì)胞），棄去舊培養(yǎng)液。加入適量PBS緩沖液（5ml培養(yǎng)瓶加入2ml緩沖液），輕輕搖動培養(yǎng)瓶（皿），使緩沖液流過所有細(xì)胞表面。倒掉緩沖液，加入適量0.25%胰蛋白酶溶液（5ml培養(yǎng)瓶加入2ml胰蛋白酶溶液）。

1. 在37℃條件下消化3-5分鐘，隨時觀察消化情況。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大或有細(xì)胞懸浮時，加入含10%血清的培養(yǎng)液，終止消化。
2. 用彎頭吸管吸取瓶（皿）內(nèi)的培養(yǎng)液，反復(fù)輕柔吹打瓶（皿）壁，使細(xì)胞脫離瓶（皿）壁后懸浮于培養(yǎng)液中。
3. 離心，棄上清液，用含10%血清的培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞。
4. 計數(shù)，分別接種在新的含10%血清的培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶（皿）內(nèi)。
5. 當(dāng)培養(yǎng)液的顏色呈黃色時（pH值下降），需要更換新的培養(yǎng)液。
6. 當(dāng)細(xì)胞增殖至整個瓶（皿）壁時，需再次傳代培養(yǎng)。

2. 懸浮生長的細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

2.1 將細(xì)胞同培養(yǎng)液一起轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，離心。

2.2 棄上清液，加入新的培養(yǎng)液，用吸管吹打使之形成細(xì)胞懸浮液。

2.3 對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)和重新接種, 細(xì)胞的接種數(shù)量可從5×10⁴～8×10⁵ 個/ml。

2.4當(dāng)培養(yǎng)液的顏色呈黃色時（pH值下降），需要進(jìn)行換液。

2.5 當(dāng)細(xì)胞增殖至覆蓋培養(yǎng)液表面時，需再次傳代培養(yǎng)。

3. 對得到的細(xì)胞系進(jìn)行鑒定和命名。通過對所培養(yǎng)細(xì)胞的核型、同功酶、細(xì)胞表面抗原、細(xì)胞骨架、DNA的分析，以對細(xì)胞的物種、組織來源以及細(xì)胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)化、有無交叉污染、有無遺傳不穩(wěn)定傾向等進(jìn)行鑒定。細(xì)胞系的命名宜采用4級命名法，即中文名由采樣的物種、品種、采樣組織、細(xì)胞系編號（用阿拉伯?dāng)?shù)字表示）組成；其縮寫名則由物種英文名稱的頭兩個字首、品種、采樣組織的英文的字首及細(xì)胞系編號組成。如從絲毛烏骨雞胚胎組織采樣所建立的成纖維細(xì)胞系1，其中文名為“絲毛烏骨雞胚胎成纖維細(xì)胞系1”，縮寫名為“ChSE1”。

4．多種細(xì)胞同時分別傳代培養(yǎng)時，操作時應(yīng)小心仔細(xì)。為防止不同細(xì)胞系間的交叉污染，超凈工作臺中一次只進(jìn)行一種細(xì)胞系的操作

5．培養(yǎng)箱中的細(xì)胞應(yīng)經(jīng)常置于顯微鏡下觀察，每周至少兩次，以檢查細(xì)胞是否生長正常和有無污染出現(xiàn)。

6．細(xì)胞傳代或更換培養(yǎng)液需要做記錄（見附表2和附表3）。記錄的內(nèi)容包括組織的來源，生物學(xué)特性，培養(yǎng)液類型，傳代、換液的時間和規(guī)律，細(xì)胞的遺傳學(xué)標(biāo)志，生長形態(tài)等。

細(xì)胞的保存（凍存）

器材與試劑：1.0.25%胰蛋白酶;2.含10% ～ 20% 的血清培養(yǎng)液；3.細(xì)胞凍存液（10% DMSO或經(jīng)高壓（15磅）滅菌的甘油，20%血清，70%細(xì)胞培養(yǎng)液）；4.吸管、離心管、凍存管。

操作步驟：

1. 選擇培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細(xì)胞（生長旺盛但尚未形成致密的單層細(xì)胞、長滿培養(yǎng)瓶（皿）以前）進(jìn)行凍存。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液。
2. 按照傳代的方法用胰蛋白酶把單層細(xì)胞消化下來，計數(shù)，離心收集細(xì)胞。
3. 棄去上清液，加入配制好的細(xì)胞凍存液，凍存液中細(xì)胞的zui終密度為5×10⁶/ml。用吸管輕輕將細(xì)胞吹打均勻，然后裝入凍存試管中，每管凍存1-1.5ml。在凍存試管上注明細(xì)胞系名稱、凍存日期和培養(yǎng)基的名稱。
4. 標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序為，初期降溫速率為-1～-2℃每分鐘；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時，可增至-5～ -10℃每分鐘；至-100℃時，則可迅速浸入液氮中。裝入凍存試管的細(xì)胞可置于細(xì)胞凍存器中，在-80℃于夜后迅速放入液氮容器內(nèi)凍存。如無此設(shè)備，可以用下兩種方法：一種是將凍存試管放入泡沫塑料盒或小紙盒中（用脫脂棉將其固定好）。放入-80℃冰箱中一夜，然后迅速放入液氮中；另一種是，將凍存試管緩緩放入液氮容器，按1℃每分鐘的降溫速度，在30-40分鐘內(nèi)使其達(dá)到液氮表面，再停30分鐘后投入液氮內(nèi)。低溫冷凍操作時應(yīng)戴厚手套，以防凍傷。
5. 用布袋盛放凍存試管凍存時，用結(jié)實的線繩一端扎住袋口，與布袋一起沉入液氮中，線另一端系一個標(biāo)簽，其上標(biāo)明細(xì)胞系名稱、凍存日期和培養(yǎng)基的名稱，垂于液氮容器外；當(dāng)用鐵架盛放凍存試管凍存時，鐵架和鐵架伸出液氮容器外的手柄上貼上標(biāo)明細(xì)胞系名稱、凍存日期和培養(yǎng)基的名稱的標(biāo)簽。
6. 對凍存的細(xì)胞系，需在凍存后兩周后復(fù)蘇一次，觀察細(xì)胞對凍存的適應(yīng)性。對已建系的細(xì)胞每6個月復(fù)蘇培養(yǎng)一次，檢查其生長狀況和是否存在污染，然后再繼續(xù)凍存。
7. 細(xì)胞凍存應(yīng)做記錄（見附表4）

細(xì)胞的復(fù)蘇

器材與試劑：1.水浴箱；2. 小型離心機(jī)；3. 吸管； 4.鑷子；5.細(xì)胞培養(yǎng)瓶（皿）；6.細(xì)胞培養(yǎng)液。

操作規(guī)程：

1. 從液氮容器內(nèi)取出細(xì)胞凍存試管，用鑷子夾住在40℃水浴中不斷搖動，使其快速融化。操作時應(yīng)戴厚手套，以防凍傷。
2. 當(dāng)凍存試管內(nèi)的液體*融化后，立即從40℃水浴中取出凍存試管，用70%酒精消毒，吸出細(xì)胞懸浮液，放入離心管中，并加入10倍體積以上的細(xì)胞培養(yǎng)液，混合后離心，棄去上清液，再用細(xì)胞培養(yǎng)懸浮，離心后用細(xì)胞培養(yǎng)液重新懸浮并計數(shù)。
3. 對復(fù)蘇后的細(xì)胞進(jìn)行接種，接種密度以5×10⁵/ml為宜。然后放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4. 冷凍細(xì)胞的復(fù)蘇應(yīng)做記錄（見附表5）

細(xì)胞的運輸

器材與試劑：1.液氮或干冰;2. 凍存試管或培養(yǎng)瓶；3.細(xì)胞培養(yǎng)液。

操作規(guī)程：

1. 短時間的運輸可將細(xì)胞放入凍存試管凍存在液氮或干冰中運輸。
2. 長時間的運輸（達(dá)4～5天）可用以下方法：

2.1 選擇生長至中或晚對數(shù)期的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液至瓶頸部，保留微量空氣，擰緊瓶蓋，用防水膠帶牢固地封好瓶蓋和瓶頸的結(jié)合部，并用泡沫塑料包裹。

2.2 到達(dá)目的地后，棄去多余的培養(yǎng)液，只保留維持細(xì)胞培養(yǎng)的液培養(yǎng)液量，放入二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，次日傳代。