牛血清白蛋白的分離純化

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>】  

掌握牛血清白蛋白分離純化各步驟（分段鹽析、離子交換層析）原理及操作方法。 

【實(shí)驗(yàn)原理】 

鹽析法是一種利用蛋白質(zhì)在不同濃度鹽溶液中溶解度不同而分離的方法。通過將鹽類加入到蛋白質(zhì)溶液中，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和，水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性因素去除而沉淀。分段改變鹽類濃度達(dá)到分離目的的方法叫分段鹽析法。  DEAE-纖維素是一種應(yīng)用廣泛的陰離子交換劑，它本身帶有正電荷，能不同程度地吸附溶液中的陰離子。層析時(shí)使用不同強(qiáng)度或不同PH值的緩沖溶液進(jìn)行分段洗脫，含負(fù)電荷少的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來，含負(fù)電荷多的蛋白質(zhì)后被洗脫下來，于是不同蛋白質(zhì)被分開。 

【實(shí)驗(yàn)器材】

 1.主要儀器   離心機(jī)、透析袋、磁力攪拌器、自動(dòng)核酸蛋白質(zhì)分離層析系統(tǒng)、分光光度計(jì)、水浴鍋。 

2.主要試劑

（1）小牛血清。 

（2）飽和硫酸銨溶液：稱取767g固體硫酸銨，加入1000ml水中，加熱使之溶解。室溫冷卻后4℃靜置一夜，然后用氨水將PH調(diào)至中性。 

（3）固體硫酸銨。

（4）聚乙二醇20000.

（5）DEAE-纖維素。 

（6）雙縮尿試劑：用適量蒸餾水分別溶解1.6克硫酸銅及6克酒石酸鉀鈉，移入1L容量瓶中。加10％NaOH300ml后，再加蒸餾水定容至1L及得。此溶液久藏不壞，但如果出現(xiàn)暗紅色沉淀，則不能使用。 

（7）0.05mol/L pH6.4PBS。 (8)0.12mol/L pH6.4PBS。 

【實(shí)驗(yàn)方法】 

1.硫酸銨分段鹽析 

（1）量取20ml血清，倒入一干凈燒杯中，緩慢加入飽和硫酸胺溶液20ml，邊加邊攪拌。放入4℃冰箱30分鐘。 

（2）從冰箱中取出燒杯，將血清倒入一離心管，3000rpm離心20分鐘。 

（3）將上清液倒入一干凈量筒中，記錄體積，傾入另一干凈燒杯中，按17.6g/100ml的量稱取固體硫酸銨，緩慢加入上清液中，邊加邊攪拌，4℃冰箱30分鐘。

（4）3000rpm離心20分鐘，沉淀用4ml 0.05mol/L pH6.4PB溶解。

（5）將上述液體對(duì)0.05mol/L pH6.4PB透析，置夜。 

（6）用聚乙二醇20000濃縮至2-3ml。此蛋白粗提液留待層析。

 2.DEAE-纖維素離子交換層析 

（1）凝膠柱準(zhǔn)備：連接自動(dòng)核酸蛋白分離層析系統(tǒng)。夾住層析柱出口，加入1/3體積的0.05mol/L pH6.4PB，灌入層析劑，待層析劑自然沉降約2cm時(shí)，打開出口。層析柱填裝完成后，蓋好蓋，調(diào)節(jié)適當(dāng)流速，平衡一夜，等待加樣。 

（2）加樣用吸管吸去膠面以上的緩沖液，立即加入蛋白粗提液（沿管壁緩慢加入）。 

（3）洗脫：打開出口，待蛋白粗提液*進(jìn)入膠內(nèi)后，用少量0.05mol/L pH6.4PB清洗管壁。用吸管補(bǔ)足層析柱膠面以上的緩沖液，用0.05mol/L pH6.4PB洗去2個(gè)層析柱體積，再換用0.12mol/L pH6.4PB洗脫并分部收集洗脫液。 

（4）檢測(cè)：用雙縮尿試劑檢測(cè)洗脫液。有蛋白質(zhì)的收集管出現(xiàn)紫紅色，分別為*蛋白峰和第二蛋白峰。收集第二蛋白峰處的各管，4℃冰箱保存，標(biāo)記為DEAE樣品。 

（5）回收層析劑。 

【注意事項(xiàng)】 

1.鹽析所用器皿一定要干燥。 

2.鹽析時(shí)，應(yīng)將飽和硫酸銨或固體硫酸銨加入到血清中，且緩慢地邊加邊攪拌。

3.層析柱上方要留有少量液體，避免使層析劑暴露于空氣中。

4.上樣前，層析柱要達(dá)到平衡。 

5.上樣時(shí)，使樣品沿管壁緩緩流下，勿沖破膠面。

6.整個(gè)層析過程要控制好流速。