T淋巴細(xì)胞分離技術(shù)

免疫細(xì)胞的分離、純化和鑒定

*節(jié) 免疫細(xì)胞的分離、純化技術(shù)

各種免疫細(xì)胞的分工與協(xié)作，共同完成免疫應(yīng)答及其調(diào)控，因此，各種免疫細(xì)胞的分離及其功能測(cè)定對(duì)于了解其在免疫應(yīng)答中的作用及相互關(guān)系有著重要意義。免疫細(xì)胞分離的方法有很多，主要是根據(jù)細(xì)胞的理化性狀、功能，以及細(xì)胞表面標(biāo)志等的差異而設(shè)計(jì)的。粘附分離法、尼龍毛柱分離法、羰基鐵分離法等主要根據(jù)細(xì)胞的屬性（如粘附）和功能不同，旨在將粘附和非粘附或粘附力較小的細(xì)胞分離開。有人證實(shí)免疫細(xì)胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分別為：巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞＞樹突狀細(xì)胞=抗體產(chǎn)生細(xì)胞＞B淋巴細(xì)胞＞T淋巴細(xì)胞=紅細(xì)胞。粘附的細(xì)胞可通過trypsin洗脫而收集。葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法和Percoll不連續(xù)密度梯度離心法等是根據(jù)細(xì)胞的大小及比重的差異進(jìn)行細(xì)胞分離。E花環(huán)沉淀分離技術(shù)主要是利用細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行細(xì)胞分離。尚可利用特異性單克隆抗體結(jié)合其它技術(shù)分選細(xì)胞，如補(bǔ)體細(xì)胞毒分離法，洗淘分離法（panning）、流式細(xì)胞術(shù)分離法，以及免疫磁珠法分離細(xì)胞技術(shù)等。一般應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的及所需細(xì)胞的種類、純度及數(shù)量等要求來確定采用何種方法。

實(shí)驗(yàn)一 Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）

外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的分離是免疫學(xué)研究中的一項(xiàng)基本技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)外分離PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法（ficoll-hypaque density gradient centrifugation），用此方法分離PBMC純度可達(dá)95％，淋巴細(xì)胞約占90％，其中T淋巴細(xì)胞占80％，B淋巴細(xì)胞占4～10％。ficoll-hypaque混合溶液，又稱淋巴細(xì)胞分層液，在分離人PBMC時(shí)，要求其比重為1.077；分離小鼠單個(gè)核細(xì)胞時(shí)比重為1.080；分離大鼠單個(gè)核細(xì)胞時(shí)比重為1.084～1.087；分離馬單個(gè)核細(xì)胞時(shí)比重為1.090。

【原理】

血液中各有形成分的比重存在差異，利用比重為1.077、近于等滲的ficoll-hypaque混合溶液（又稱淋巴細(xì)胞分層液）作密度梯度離心時(shí)，各種血液成分將按密度梯度重新聚集。血漿和血小板由于密度較低，故懸浮于分層液的上部；紅細(xì)胞與粒細(xì)胞由于密度較大，故沉于分層液的底部；PBMC密度稍低于分層液，故位于分層液界面上，這樣就可獲得PBMC。

【器材與試劑】

1.刻度離心管、吸管、試管、毛細(xì)吸管、橡皮乳頭、載玻片、蓋玻片、離心機(jī)等。

2.pH7.2 Hanks液、肝素、生理鹽水溶液，淋巴細(xì)胞分層液。（8.2%的聚蔗糖溶液28份，35.7%泛影葡胺10份）

【方法】

1.靜脈取血2ml，加入含肝素溶液(10～50u／m1血樣本)的試管中，混勻，使血液抗

凝。用pH7.2 Hanks液或生理鹽水將抗凝血稀釋1倍。

2.吸取2ml淋巴細(xì)胞分層液置于刻度離心管中，然后將離心管傾斜45^O角，用毛細(xì)滴管將稀釋的全血沿管壁緩慢加至分離液上面，應(yīng)注意保持兩者界面清晰。

3.在18℃～20℃下，用水平離心機(jī)以2000r/min離心20min。離心后細(xì)胞分布如圖。

    4.用毛細(xì)吸管輕輕插到混濁帶，沿管壁輕輕吸出此層細(xì)胞，移入另一支離心管中。即要吸取所有單個(gè)核細(xì)胞，又要避免吸取過多的分層液或血漿，以免混入其他細(xì)胞成分。

5.用Hanks液洗滌細(xì)胞3次。*次2000r/min ，10 min；第2～3 次1500r/min ，10 min，可去掉大部分混雜的血小板。

6.將沉淀細(xì)胞懸于培養(yǎng)基中備用。

【注意事項(xiàng)】

1、實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿應(yīng)該潔凈。如果制備的單個(gè)核細(xì)胞懸液用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，上述操作過程都要在無菌條件下進(jìn)行，所用器材、試劑都應(yīng)為無菌。

2、實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞得率與室溫及分層液比重等有關(guān)。分層液應(yīng)避光4℃保存。

3、往淋巴細(xì)胞分層液中加入稀釋全血時(shí)，不得將血液沖入分離液中，須保持兩層液體的清晰界面。

實(shí)驗(yàn)二  免疫磁珠法分離淋巴細(xì)胞

[原理]

免疫磁珠法分離細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場(chǎng)中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場(chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離。

根據(jù)免疫磁珠（immune magnetic bead，IMB）的種類，免疫磁珠法分離細(xì)胞可分為直接法和間接法。直接法即將特異性抗體與磁珠相連，IMB可與表達(dá)相應(yīng)膜抗原的細(xì)胞結(jié)合，在磁性分離器（磁架）作用下，連有磁珠的細(xì)胞被吸附在磁架上，從而與其他細(xì)胞分離。間接法即將二抗與磁珠相連，磁珠通過二抗與一抗相結(jié)合，一抗與細(xì)胞表面抗原結(jié)合，因此使磁珠與細(xì)胞相連，從而在磁場(chǎng)作用下，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離。直接法分離得到的連有磁珠的細(xì)胞可直接用于功能實(shí)驗(yàn)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。間接法分離得到的連有磁珠的細(xì)胞須再培養(yǎng)2天，待磁珠從細(xì)胞上脫落下來，才能進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。近年來，開發(fā)了生物素標(biāo)記的單抗--親和素/鏈霉親和素—生物素結(jié)合的磁珠實(shí)驗(yàn)體系（BAB法）。利用生物素和親和素之間的高親和力及生物放大效應(yīng)來增強(qiáng)IMB與細(xì)胞的特異性結(jié)合，從而提高細(xì)胞分離效率。為了分離后迅速進(jìn)行分離效果分析，目前有研究者將熒光素（如FITC）標(biāo)記在親和素/鏈霉親和素表面，使所分離的細(xì)胞在流式細(xì)胞儀上馬上得到檢測(cè)，從而省去了免疫熒光染色的時(shí)間。

根據(jù)磁珠結(jié)合的細(xì)胞與所要獲得的細(xì)胞的關(guān)系，免疫磁珠法分離細(xì)胞可分為正選法和負(fù)選法。正選法即磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞，負(fù)選法即磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞，游離于上清液的細(xì)胞為所需細(xì)胞。還有一種基于負(fù)選法的分離方法，即在實(shí)驗(yàn)體系中加入連接有磁珠的多種單抗，通過磁性分離器后，則所有不需要的細(xì)胞被吸附在磁架上，未被吸附的細(xì)胞為目的細(xì)胞。這種方法可一次去除多種細(xì)胞，又稱雞尾酒法（cocktail）。

免疫磁珠法分離細(xì)胞是一種90年代初興起的新型細(xì)胞分離技術(shù)，所獲細(xì)胞純度高（93%-99%），獲率可達(dá)90%，活細(xì)胞率大于95%，且操作簡(jiǎn)單，不需使用離心沉淀分離技術(shù)，省時(shí)且費(fèi)用低。

以下介紹免疫磁珠間接法分離淋巴細(xì)胞（正選法）（以Immunotech公司產(chǎn)品為例）。

【器材與試劑】

連接有磁珠的二抗，抗體（一抗）、PBS+0.2%BSA、PBS+1.2%BSA、PBS+30%FCS、磁架、玻璃管等。

【方法】

1．取適量磁珠懸液，用20倍體積的PBS+0.2%BSA溶液重懸后，置磁架上5min。（磁珠與單個(gè)核細(xì)胞或全血的比例為：0.5mg磁珠/1×10⁷個(gè)單個(gè)核細(xì)胞或1ml全血）

2．吸去上清，以去除在儲(chǔ)存過程中從磁珠上脫落的二抗。用100ul PBS+0.2%BSA溶液重懸磁珠。加入一抗（一抗與磁珠的比例為：5ug一抗/1mg磁珠），置室溫15 min，中間輕微晃動(dòng)二次。再置磁架上5min。

3．加入2ml PBS+1.2%BSA溶液，再置磁架上5min。吸去上清，以去除未與二抗結(jié)合的一抗。重復(fù)操作一次。用100ul PBS+0.2%BSA溶液重懸磁珠。

4．用PBS+30%FCS調(diào)整待分離細(xì)胞的濃度為1×10⁷細(xì)胞/ml，將細(xì)胞加入磁珠懸液中，置室溫10min，中間輕微晃動(dòng)一次。然后置磁架上10min。吸去上清。

5．用*培養(yǎng)基重懸磁珠結(jié)合的細(xì)胞后直接進(jìn)行培養(yǎng)。

[注意事項(xiàng)]

1．若采用負(fù)選法分離細(xì)胞，磁珠與細(xì)胞比例為：1mg磁珠/1×10⁷單個(gè)核細(xì)胞或1ml全血。

2．待分離的細(xì)胞懸液應(yīng)盡量是單細(xì)胞懸液，避免細(xì)胞粘附成團(tuán)，以免影響分離效果。

血清滅活處理步驟

① 選用與血清瓶同規(guī)格的對(duì)照瓶一個(gè)。

② 對(duì)照瓶?jī)?nèi)放入與血清等體積的水。

③ 溫度預(yù)試：

　　對(duì)照瓶?jī)?nèi)插入2—3支經(jīng)挑選的溫度計(jì)(保證測(cè)試溫度的準(zhǔn)確性)，放入水浴箱中，接 通電源，調(diào)節(jié)溫度控制鈕，使水浴箱溫度所示溫度保持在56℃。

④ 血清滅活：

　　血清瓶與帶溫度計(jì)的對(duì)照瓶一齊放入水浴箱中，待溫度計(jì)所示溫度上升至56℃時(shí)， 定時(shí)30分鐘。

⑤ 大瓶血清滅活后，進(jìn)行分裝

⑥保存

　　分裝后，抽樣做無菌試驗(yàn)，－20～－70℃保存。

　　血清的熱滅活是很多培養(yǎng)者感興趣的話題，價(jià)格不菲的血清中含有諸如生長(zhǎng)因子，維生素，氨基酸等珍貴物質(zhì)，而將它們置于50℃以上的溫度長(zhǎng)達(dá)30分鐘是*沒有必要的。盡管如此，在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室之中血清的熱滅活還是作為常規(guī)來執(zhí)行，多數(shù)實(shí)驗(yàn)者并沒有考慮熱處理對(duì)血清中的生長(zhǎng)因子，氨基酸等成分帶來的負(fù)面影響，在我們的技術(shù)中zui常被提到的就是否該對(duì)血清進(jìn)行熱滅活，下面我們就對(duì)胎牛血清的熱滅活進(jìn)行一些探討和解釋。