單克隆抗體

基本概念
　　抗體主要由B淋巴細(xì)胞合成。每個B淋巴細(xì)胞有合成一種抗體的遺傳基因。動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細(xì)胞系，含遺傳基因不同的B淋巴細(xì)胞合成不同的抗體。當(dāng)機體受抗原刺激時，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個具有不同基因的B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖形成該細(xì)胞的子孫，即克隆由許多個被激活B細(xì)胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多種抗體。如果能選出一個制造一種專一抗體的細(xì)胞進行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成一種決定簇的抗體，稱為單克隆抗體（monoclonal antibody,McAb）。
制備原理
　　要制備單克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細(xì)胞，但這種B淋巴細(xì)胞不能在體外生長。而實驗發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞可在體外生長繁殖，應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細(xì)胞。這種雜種細(xì)胞繼承兩種親代細(xì)胞的特性，它既具有B淋巴細(xì)胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性，用這種來源于單個融合細(xì)胞培養(yǎng)增殖的細(xì)胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異。其制備原理示意如下：


優(yōu)點
　　與常規(guī)抗體相比有如下優(yōu)點：
1. 單一特異性，與一個抗原決定簇反應(yīng)；
2.  可重復(fù)性，能夠提供*一樣的抗體制劑；
3. 一經(jīng)制出，可無*地供應(yīng)；
4. 生產(chǎn)，不一定需要純的抗原；
5. 能查出混合物中存在的用常規(guī)方法查不出的少量成分。
制備方法

1975年Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進行融合，形成的雜交瘤細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無性繁殖，從而創(chuàng)立了雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破使血清學(xué)的研究進入了一個高度的新紀(jì)元。
　　采用雜交瘤技術(shù)制備包括動物免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存以及的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過幾個月的一系列實驗步驟。
主要儀器設(shè)備：
　　超凈工作臺、CO2恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（-70℃）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機（水平轉(zhuǎn)子，4000r/min）、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，500ml、250ml、100ml鹽水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，融合管（50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管），眼科剪刀，眼科鑷，血細(xì)胞計數(shù)板，可調(diào)微量加樣器（~50ul，~200ul，~1000ul），彎頭針頭，200目篩網(wǎng)，小鼠固定裝置等。此外，一般的制備方法大同小異。
方法：
動物的選擇與免疫
1. 動物的選擇 　
　　純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實驗室均能飼養(yǎng)成活。目前開展雜交瘤技術(shù)的實驗室多選用純種BALA/C小鼠。
2. 免疫方案 　　
　　選擇合適的免疫方案對于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般在融合前兩個月左右根據(jù)確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。
　　（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏*佐劑、福氏不*佐劑。
　　初次免疫 抗原1～50μg加福氏*佐劑皮下多點注射或脾內(nèi)注射（一般0.8～1ml,0.2ml/點）
　　↓3周后
　　第二次免疫 劑量同上，加福氏不*佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）
　　↓3周后
　　第三次免疫 劑量同一，不加佐劑，ip（5～7天后采血測其效價）
　　↓2～3周
　　加強免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv（靜脈內(nèi)注射）
　　↓3天后
　　取脾融合
　　目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應(yīng)答水平，增強免疫細(xì)胞對抗原的反應(yīng)性。
　　（2）顆?？乖庖咝詮?，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細(xì)胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為1～2×107個細(xì)胞。
　　初次免疫 1×107/0.5ml ip
　　↓2～3周后
　　第二次免疫 1×107/0.5ml ip
　　↓3周后
　　加強免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv
　　↓
　　取脾融合
細(xì)胞融合
細(xì)胞融合前準(zhǔn)備
1. 骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用的骨髓瘤細(xì)胞系見下表。
用于融合試驗的主要骨髓瘤細(xì)胞系

的純化

1. 腹水型單抗的純化
   在單抗純化之前，一般均需對腹水進行預(yù)處理，目的是為了進一步除去細(xì)胞及其殘渣、小顆粒物質(zhì)、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和過濾離心法，以前者處理效果為佳，而且操作簡便。
（1） 二氧化硅吸附法：
　　新鮮采集的腹水（或凍存的腹水），2000r/min 15分鐘，除去細(xì)胞成分（或凍存過程中形成的固體物質(zhì)）等；取上層清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥緩沖鹽水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀釋；然后以每10ml稀釋腹水中加150mg二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鐘，不時搖動；2000g離心20分鐘，脂質(zhì)等通過該法除去，即可得澄清的腹水。
（2） 過濾離心法：
　　用微孔濾膜過濾腹水，以除去較大的凝塊及脂肪滴；用10000g 15分鐘高速離心（4℃）除去細(xì)胞殘渣及小顆粒物質(zhì)。
（3） 混合法：
　　即上述兩法的組合，先將腹水高速離心，取上清液再用二氧化硅吸附處理。
2. 單抗的粗提
（1） 硫酸銨沉淀法
A. 飽和硫酸銨溶液的配制：
　　500g硫酸銨加入500ml蒸餾水中，加熱至*溶解，室溫置夜，析出的結(jié)晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/L NaOH調(diào)PH至7.8。
B. 鹽析：
　　吸取10ml處理好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶液5.0ml；繼續(xù)緩慢攪拌30分鐘；10000r/min離心15分鐘；棄去上清液，沉淀物用1/3飽和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30分鐘，同法離心；重復(fù)前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl緩沖液中。
C. 脫鹽：
　　常用柱層析或透析法。柱層析法是將鹽析樣品過Sephadex G-50層析柱，以PBS或Tris-HCl緩沖液作為平衡液和洗脫液，流速每分鐘1ml。*個蛋白峰即為脫鹽的抗體溶液。透析法是將透析袋于2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分鐘，用蒸餾水清洗透析袋內(nèi)外表面，再用蒸餾水煮透析袋10分鐘，冷至室溫即可使用（并可于0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存?zhèn)溆茫Ⅺ}析樣品裝入透析袋中，對50-100倍體積的PBS或Tris-HCl緩沖液透析（4℃）12-24小時，其間更換5次透析液，用萘氏試劑檢測，直至透析外液無黃色物形成為止。
D. 蛋白質(zhì)含量的測定：
　　　　　（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀釋倍數(shù)；或（Pr）=OD280×稀釋倍數(shù)/1.3
E. 分裝凍存?zhèn)溆谩?/span>
（2） 辛酸-硫酸銨沉淀法
　　該法簡單易行，適合于提純IgG1和IgG2b，但對IgG3和IgA的回收率及純化效果差。其主要步驟如下：取1份預(yù)處理過的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸緩沖液，用1mol/L HCl調(diào)PH至4.8；按每毫升稀釋腹水加11ul辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，于30分鐘內(nèi)加完，4℃靜置2小時，取出15000g離心30分鐘，棄沉淀；上清經(jīng)尼龍篩過濾（125um），加入1/10體積的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH調(diào)PH至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45%飽和度，作用30分鐘，靜置1小時；10000g離心30分鐘，棄上清；沉淀溶于適量PBS（含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA）中，對50-100倍體積的PBS透析，4℃置夜，其間換水3次以上；取出10000g離心30分鐘，除去不溶性沉渣，測定蛋白質(zhì)含量后，分裝，凍存?zhèn)溆谩?/span>
（3） 優(yōu)球蛋白沉淀法
　　該法適用于IgG3和IgM型單抗的提取，所獲制品的抗體活性幾乎保持不變，對IgG3單抗的回收率高于90%，對IgM單抗的回收率為40-90%不等。其操作步驟如下：取一定量的預(yù)處理過的腹水，先后加入NaCl和CaCl2，使各自的濃度分別達0.2mol/L和25mmol/L，隨之可見纖維蛋白的產(chǎn)生；經(jīng)濾紙過濾后，濾液對100倍體積的去離子水透析，4℃ 8-15小時（若是IgG3單抗，也可室溫2小時），其間換水1-2次；取出后22000g離心30分鐘，棄上清；將沉淀溶于PH8.0 1mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl溶液中，重復(fù)上述的透析與離心；將沉淀的優(yōu)球蛋白濃度調(diào)至5-10mg/ml，分裝凍存?zhèn)溆谩?/span>
3. 單抗純化的方法
　　單抗純化的方法有很多種，應(yīng)根據(jù)具體單抗的特性和實驗條件選擇適宜的方法，常用的技術(shù)有DEAE離子交換層析柱、凝膠過濾法和親和層析法三種。這些方法可以參閱蛋白技術(shù)討論專題區(qū)的純化方法介紹。