細胞的細菌、真菌污染及排除

真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中zui常見的一種，尤其在梅雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易污染。污染培養(yǎng)細胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見于細胞之間縱橫交錯穿行的絲狀、管狀、及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細胞周邊和細胞之間生長。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細胞生長變慢，但zui后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。

                              真菌感染

細菌是一種原核細胞微生物，其大小以微米(μm)計。常見的污染細菌有革蘭氏陰性菌和大腸桿菌、假單胞菌等，革蘭氏陰性菌中白色葡萄球菌等比較常見。一旦發(fā)生細菌污染較易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象；有時靜置的培養(yǎng)液液體初看不混濁，但稍加振蕩，就有很多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。必要時可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以證實細菌種類；有的培養(yǎng)液改變不明顯而又疑有污染，可取出少量培養(yǎng)液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可取10ml細胞懸液以100rpm離心5min，沉淀中加入無抗生素的培養(yǎng)液2ml，置于37℃培養(yǎng)，24h可得結(jié)果。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，zui后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株(系)丟失。

                              細菌污染

細菌和真菌污染多在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且由于增生迅速，多再發(fā)生污染48h以內(nèi)就已明顯。在實驗的zui初兩天密切觀察實驗樣品是否有污染發(fā)生，有利于及時采取措施予以補救或排除。

培養(yǎng)細胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細胞價值不大，宜棄之；有細胞株留存的或可購置的，可在尋找原因后*消毒操作室和二氧化碳培養(yǎng)箱(若發(fā)現(xiàn)真菌污染，可在污染孔內(nèi)加入1mol/L氫氧化鈉或硫酸銅溶液處理)(具體操作方法可參考細胞培養(yǎng)污染的預(yù)防)，復蘇或重新購置細胞，再培養(yǎng)。若污染細胞價值較大，又難于重新得到，可采用5～10倍于常用量的抗生素沖擊，加入高濃度抗生素后作用24～48h，再換入常規(guī)培養(yǎng)液，有時可能奏效。細胞培養(yǎng)中常用的抗生素及用量見下表。

常用抗生素用量和效應(yīng)

+表示效應(yīng)程度

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。

1.在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細胞，稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。

2.分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3.每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。

4.確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2～3代。

5.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代。

6.重復步驟4。

7.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代，確定污染是否以已被消除。