一、 實驗目的

熟練掌握培養(yǎng)基(RPMI1640和DMEM)的配制，了解其他培養(yǎng)基配制方法。

二、 實驗原理

組織培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基一般是由合成培養(yǎng)基和小牛血清配制而成。合成培養(yǎng)基有商品出售，它是根據細胞生長的需要按一定配方制成的粉狀物質。其主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子和其他輔助物質。它的酸堿度和滲透壓與活體內細胞外液相似。小牛血清含有一定的營養(yǎng)成分，更重要的是它含有細胞生長所必須得生長因子、激素、貼附因子等，這是合成培養(yǎng)基所無法替代的。此外它還能中和有毒物質的毒性。故一般體外培養(yǎng)細胞時要加入一定量的小牛血清(10%-20%)。

三、 儀器、材料和試劑

儀器：濾泵一套、濾器一套、蒸餾器、高壓滅菌鍋、磁力攪拌器。

材料：3000ml錐形瓶、250ml或500ml培養(yǎng)瓶、翻冒塞、飯盒、pH試紙、孔徑0.22μm的微孔濾膜。

試劑：鹽酸、無離子水、小牛血清、合成培養(yǎng)基(RPMI1640)、青霉素、鏈霉素、NaHCO3。

四、 實驗步驟

(一) 準備和安裝濾器

在超凈工作臺內打開包有清洗滅菌好的過濾器的牛皮紙，并架好。膠管一段接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管伸入到已消毒的瓶子中。用濾泵做正壓過濾，壓力數(shù)字為2。過濾后檢查濾膜是否完好無損。

(二) 合成培養(yǎng)基的配制

1、 取3000ml三蒸水，加入合成培養(yǎng)基干粉，用磁力攪拌一定時間(2-4h)使之充分溶解。

2、 通入適量CO2 或加入6mol/L鹽酸調pH至6.0左右。

3、 加入一定量的NaHCO3調節(jié)pH至7.0左右。

4、 加水至zui終體積。

5、 在超凈工作臺中對溶液進行過濾除菌，分裝入250ml或500ml培養(yǎng)瓶中，用翻冒塞塞緊瓶口。

6、 4℃冰箱儲存(可以-20℃儲存)。

(三) 小牛血清的處理

市場上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還要做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補體。

1、 將血清加熱到56℃并保存30min，期間要不時的輕輕搖晃，使受熱均勻，防止沉淀析出;

2、 處理后的血清儲存于4℃;

3、 小牛血清在使用前進行篩選以掌握血清的質量。

(四) 生長培養(yǎng)基的配制

除無血清培養(yǎng)之外，各種合成培養(yǎng)基在使用前需要加入一定量的小牛血清和抗生素。

1、培養(yǎng)基分裝成小瓶(100ml-200ml)以便使用，翻冒塞塞緊瓶蓋;

2、按以下比例配制：

基本培養(yǎng)基占80%-90%，小牛血清占10%-20%。

按1%體積分數(shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使用青霉素和鏈霉素的終濃度分別是100U/ml和100μg/ml。

五、 注意事項

1、 培養(yǎng)細胞使用的瓶子和飯盒應與提取RNA和培養(yǎng)細菌的瓶子和飯盒嚴格分開。因為用于處理提取RNA的DEPC水(0.1%焦炭酸二乙酯)是一種致癌物，可能影響細胞生長;而培養(yǎng)過細菌的用品也不應與細胞混用。

2、 過濾時壓力不可過大，否則細菌易濾過達不到除菌效果，或使濾膜破裂。分裝時需根據使用量的多少選擇合適大小的瓶子，并且每瓶只能裝2/3體積的液體，過多時瓶子易爆或膠塞自噴。

3、 濾器用畢立即刷洗，過蒸餾水，晾干收藏。