人褪黑素(MT)ELISA試劑盒說明書

本試劑盒僅供研究使用

檢測范圍：25 ng/ml-400 ng/ml

zui低檢測限：12.5 ng/ml

特異性：本試劑盒可檢測人MT，且與其他相關(guān)物質(zhì)無交叉反應(yīng)。

有效期：6個月

預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中MT含量。

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。

2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

實驗原理

本試劑盒采用酶聯(lián)免疫直接競爭法檢測MT。微孔板上包被有抗體MT抗體。加入MT標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，然后加入生物素標(biāo)記的MT。樣品中的MT、生物素標(biāo)記MT與固相板上的抗MT抗體發(fā)生競爭結(jié)合。再向微孔中加辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，形成固相抗體-生物素化MT-親和素-HRP復(fù)合物。經(jīng)加底物顯色后，隨著樣品中MT濃度的升高，顯色OD值呈逐漸下降的線性關(guān)系。

試劑盒組成及試劑配制

1. 酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊（96孔）。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：5×1ml/瓶。

1. 生物素標(biāo)記MT：1×6ml/瓶。
2. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-Avidin ）：1×6ml/瓶。
3. 底物溶液A（Substrate A）：1×6ml/瓶。
4. 底物溶液B（Substrate B）：1×6ml/瓶。
5. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×15ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋20倍。
6. 終止液（Stop Solution）：1×6ml/瓶（2N H₂SO4）。

需要而未提供的試劑和器材

1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2. 高速離心機(jī)
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 超聲清洗器
5. 干凈的試管和Eppendof管
6. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
7. 蒸餾水，容量瓶等

標(biāo)本的稀釋原則：

首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。

濃洗滌液稀釋原則：

臨用前用蒸餾水進(jìn)行20倍稀釋。如有鹽析出，稀釋后水浴加溫助溶。

操作步驟

實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時，先進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓?/span>不加任何溶液，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品50ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，然后在所有孔中加入50 ul 生物素標(biāo)記MT（空白孔中不加）。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)60分鐘（為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液）。
2. 溫育后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3-5次，每次浸泡10秒，約200ul/每孔，甩干。
3. 所有孔中加入50 ul辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)30分鐘
4. 按步驟2進(jìn)行洗滌。
5. 依序每孔加底物溶液A和B各50ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，一般10-15分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的后3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，前3-4孔顏色不明顯，即可終止）。
6. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
7. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。

注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。

2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。

4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存。

5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

計算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1. 當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。
5. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
6. 底物請避光保存。
7. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。