一、材料與設(shè)備

(一) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生后 1-4 天 SD 乳鼠 15 只。

(二) 實(shí)驗(yàn)試劑

低糖 DMEM、胰酶(含 EDTA)、青鏈霉素、碳酸氫鈉液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。0.1%新潔爾滅、碘酒、75%酒精。

培養(yǎng)液：培養(yǎng)液(DMEM，新生牛血清，青鏈霉素)。

(三) 器械與儀器

鋁盒、眼科直剪、眼科彎剪、眼科直鑷、眼科彎剪、玻璃培養(yǎng)皿(共 2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心臟組織)、100 ml 廣口瓶?jī)蓚€(gè)(分別裝碘酒和酒精棉球)、500 ml 燒杯、250 ml 錐形瓶、15 ml和 50 ml 的離心管，磁力攪拌器和攪拌子(或者水浴振蕩器)、150-200 目尼龍篩網(wǎng)和針式濾器。

二、實(shí)驗(yàn)流程

(一) 實(shí)驗(yàn)步驟

1. 將胰酶用 D-Hank's 液配成 0.06%的濃度，并放置于 37℃水浴中溫育好。

2. 解剖取材：將乳鼠放入 0.1%新潔爾滅浸泡一下后拿出，用另一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚，再用酒精棉球脫碘。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪開 皮，充分撕拉開，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科彎剪沿胸骨柄左下緣向上剪開肋骨，然后在切口中間橫剪胸骨。這樣只要左手稍頂，乳鼠的心臟就直接跳出來(lái)。 然后用眼科彎鑷從心臟中部直接將心室部分剪下，放入冰浴的 D-Hank's 液中。重復(fù)以上過(guò)程。取材完畢后，撤掉取材的手術(shù)器械。注：為了保證心肌細(xì)胞的活力，取心的操作過(guò)程盡量快，另外，把盛的心臟的培養(yǎng)皿放置在冰臺(tái)上或 者預(yù)冷的平衡鹽液中。

3. 用第二套手術(shù)器械進(jìn)行下列操作。用眼科直鑷和眼科彎剪把培養(yǎng)皿中的心臟周邊的血凝塊及纖維組織剔除掉，放在另一個(gè)預(yù)先裝好D-Hank's液的培養(yǎng)皿中，把心臟組織再洗一遍后，將心臟組織放在另外一個(gè)培養(yǎng)皿中(或者其它合適容器中，視個(gè)人習(xí)慣)，加少許 0.06%胰酶，用眼科彎剪將心臟組織剪成 1mm3大小的碎塊，將剪碎的心臟和胰酶液轉(zhuǎn)入加了攪拌子的錐形瓶中，另外吸取 2-3 ml新鮮的胰酶沖洗平皿和剪刀并轉(zhuǎn)入錐形瓶中，補(bǔ)加胰酶至終體積10 ml，加上塞子，放在 37℃水浴中(可以用一個(gè)消毒的500 ml燒杯，裝好無(wú)菌的蒸餾水，加夠水量，水位線稍低于250 ml錐形瓶的刻度線即可，過(guò)少則溫度會(huì)不均勻，過(guò)高容易污染。打開磁力攪拌器電源，預(yù)先將水溫調(diào)節(jié)到 37℃)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至 60 rpm左右，消化15 min(務(wù)必保證水浴溫度恒定在 37℃，并且消化時(shí)間不超過(guò) 15 min)?；蛘撸绻捎玫氖撬≌鹗幤鞯脑挘挥眉訑嚢枳?，直接放在水浴震蕩器中消化亦可，轉(zhuǎn)速和消化時(shí)間相同。

4. 從水浴中取出錐形瓶，小心吸去上清，上清中的主要成分是血紅細(xì)胞和成纖維類細(xì)胞。

5. 加入10 ml 新的胰酶，用一支新的吸管吹打溶液幾次，機(jī)械分散細(xì)胞(組織消化后會(huì)成為粘稠的膠體狀)，注意：不要過(guò)分吹打，否則會(huì)導(dǎo)致組織過(guò)度消化，37℃水浴攪拌再消化 10-15 min；如果乳鼠數(shù)目少(比如 5、6 只的時(shí)候)，消化時(shí)間可以減少為 5-10 min，否則很容易消化過(guò)度。上述消化處理的同時(shí)，往一支 50 ml 的一次性無(wú)菌離心管中加入 20 ml 預(yù)冷的含 10%血清的培養(yǎng)液，并放置冰臺(tái)上。消化處理之后，小心移出上清轉(zhuǎn)至上述加有培養(yǎng)液的離心管中，*次消化收集的分離出的細(xì)胞，*次消化結(jié)束后；繼續(xù)第二次消化，余下的組織塊加入 10 ml 新胰酶繼續(xù)消化。

6. 重復(fù)第5步消化步驟，直至剩余少許組織塊為止，一般消化 4-5 次可以消化絕大多數(shù)的組織塊(不含棄去消化液的那次)。

7. 第 1、2 次含細(xì)胞的消化液放在一根離心管中，過(guò) 180 目篩網(wǎng)后，一起離心；第 3、4 次含細(xì)胞的消化液放在一根離心管中，過(guò) 180 目篩網(wǎng)后，一起離心。zui后，分別用 8 ml含 20%血清的培養(yǎng)液重懸兩管細(xì)胞，接種到一個(gè) 75 cm²的塑料培養(yǎng)瓶中，放置在培養(yǎng)箱中 1.5 小時(shí)后，取出，棄貼壁細(xì)胞(主要是成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)，將未貼壁的細(xì)胞懸液取出，臺(tái)盼籃拒染法計(jì)數(shù)后，加入培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5-6×10⁵個(gè)/ml，接種到目的培養(yǎng)器皿中。

8. 一般不用加BrdU，如果培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)(發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞也極少)，可以加入 0.1 mmol/ml BrdU(Sigma)以阻止成纖維細(xì)胞增殖。加了BrdU，心肌細(xì)胞搏動(dòng)的持續(xù)時(shí)間會(huì)更長(zhǎng)。

9. 接種后 24 小時(shí)，用溫的培養(yǎng)基或者平衡鹽液輕輕沖洗培養(yǎng)的心肌細(xì)胞一次，以去處未貼壁的細(xì)胞(部分細(xì)胞會(huì)在 24 小時(shí)后貼，結(jié)果很多細(xì)胞重疊生長(zhǎng))，再更換培養(yǎng)液，即可?？梢园凑諏?shí)驗(yàn)需要在培養(yǎng) 48 h 或 72 h 后施加處理因素。

(二) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

心肌細(xì)胞剛接種時(shí)形狀為圓形或橢圓形，大約在 24 h左右基本貼壁，此時(shí)細(xì)胞伸出偽足，偽足在鏡下為纖維狀條索，細(xì)胞胞體則呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，如多角形，部分細(xì)胞有聚集傾向，細(xì)胞搏動(dòng)效果較好，DMEM培養(yǎng) 基在初始培養(yǎng)時(shí)為深紅色，兩天后變?yōu)榈S色，應(yīng)該是營(yíng)養(yǎng)成分下降的表現(xiàn)，也說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好。我們也參考了一些國(guó)外文獻(xiàn)的培養(yǎng)方法加以補(bǔ)充。鑒定的zui 簡(jiǎn)單的辦法就是搏動(dòng)與否，注意：當(dāng)搏動(dòng)比較微弱的時(shí)候，在 10 倍物鏡下可能看不到搏動(dòng)，換成20 或40倍的物鏡可能能觀察到。檢驗(yàn)操作是否合格的的辦法就是看心肌細(xì)胞的純度和搏動(dòng)能力。另外，心肌細(xì)胞表達(dá)肌動(dòng)蛋白，可以作為鑒定，但不是*的特 征性指標(biāo)，因?yàn)槠交〖?xì)胞也表達(dá)。

三、經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

(一) 新生大鼠鼠齡的選擇

新生大鼠心肌細(xì)胞在出生后3 d內(nèi)具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌細(xì)胞則為終末分化細(xì)胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生時(shí)間越短，其心肌細(xì)胞分離后成活率越高，越容易貼壁生長(zhǎng)。大量觀測(cè)表明，選擇1~3 d齡大鼠分離其心肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)較為理想。其中尤以半日齡大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)效果*。　

(二) 消化酶的選擇及使用

新生大鼠心肌細(xì)胞的分離可采用組織塊法和消化法，前者因不易獲得密度均一的細(xì)胞且難控制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)而較少采用。消化法中常使用的酶有3種：胰蛋白 酶、膠原酶I或II以及透明質(zhì)酸酶。透明質(zhì)酸酶多與胰蛋白酶或膠原酶聯(lián)合應(yīng)用。胰蛋白酶作用較強(qiáng)，容易造成心肌細(xì)胞損壞。膠原酶作用較緩和，能消化細(xì)胞間 質(zhì)中的膠原纖維以釋放細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞損傷小，且在新生大鼠心肌組織，以膠原I為主,故我們選用膠原酶I。文獻(xiàn)報(bào)道膠原酶的工作濃度一般在0.6~1 g?L^-1，我們使用的為0.8 g?L^-1。膠原酶現(xiàn)用現(xiàn)配。

(三) 消化程度的把握

新生大鼠心肌細(xì)胞對(duì)酶消化極為敏感。消化過(guò)度可使肌原纖維出現(xiàn)萎縮，細(xì)胞死亡率增加或喪失貼壁能力及搏動(dòng)能力；消化不足，細(xì)胞聚集成團(tuán)，無(wú)法分清細(xì)胞邊界，難以形態(tài)學(xué)觀測(cè)。消化過(guò)程中使用磁力攪拌器時(shí)應(yīng)注意1)轉(zhuǎn)速一般控制在60~80 r?min^-1左右。(2)每次消化的時(shí)間須結(jié)合消化酶濃度確定。(3)將粘附在攪拌子上的心肌組織吹散，使酶液充分接觸組織。(4)適宜溫度為35~37℃。(5)當(dāng)組織由紅轉(zhuǎn)白呈半透明狀態(tài)時(shí)，應(yīng)停止消化。

(四) 接種的細(xì)胞密度

　心肌細(xì)胞接種密度不僅影響細(xì)胞間的相互接觸，進(jìn)而影響細(xì)胞對(duì)肥大刺激的反應(yīng)，而且影響長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞的成活率。接種細(xì)胞的數(shù)量應(yīng)經(jīng)計(jì)算。一般而言，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的觀測(cè)目的決定單位面積上的細(xì)胞數(shù)量。例如，如作形態(tài)學(xué)觀測(cè),六孔板中每孔的接種細(xì)胞數(shù)量應(yīng)控制在1×10⁵~2×10⁵個(gè)；若需收獲心肌細(xì)胞作mRNA或蛋白表達(dá)水平的觀測(cè)，則每孔的接種密度可增加到5×10⁵~6×10⁵個(gè)。

(五) 細(xì)胞的分散度與接種的均勻性

分離出的心肌細(xì)胞，在溶液中Ca²⁺作用下較容易出現(xiàn)集聚現(xiàn)象。因此，在進(jìn)行 差速貼壁前后，均應(yīng)反復(fù)多次地輕柔吹打使心肌細(xì)胞成單個(gè)分散狀態(tài)。接種后，應(yīng)小心使心肌細(xì)胞均勻地分布于培養(yǎng)板上,避免細(xì)胞向培養(yǎng)孔的中央集聚。此外，可 將培養(yǎng)板放入孵箱后用滴管輕輕吹打各孔中央部位2~3次，但應(yīng)格外注意避免污染。

(六) 對(duì)成纖維細(xì)胞的抑制與血清種類的選擇

成纖維細(xì)胞較心肌細(xì)胞更容易貼壁且具有分裂增殖能力，經(jīng)差速貼壁后仍有少量成纖維細(xì)胞混雜于心肌細(xì)胞之中，若處理不當(dāng)，很容易生長(zhǎng)成優(yōu)勢(shì)細(xì)胞。溴脫氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干擾細(xì)胞的有絲分裂，故常規(guī)使用BrdU抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。但是，如果使用胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞，由于胎牛血清所含的促細(xì)胞有絲分裂的因子較多，BrdU很難*抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。改用小牛血清則可克服這種現(xiàn)象的出現(xiàn)，獲得高達(dá)90％以上的心肌細(xì)胞。

(七) 換液時(shí)間

進(jìn)行心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀測(cè)時(shí)，接種密度較低，貼壁的心肌細(xì)胞數(shù)量減少，為避免成活心肌細(xì)胞隨換液而被丟棄，應(yīng)在接種48 h后換液。這樣不僅使貼壁的心肌細(xì)胞數(shù)量明顯增加，而且BrdU作用時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)成纖維細(xì)胞的抑制作用更確實(shí)。此外，去血清后可用ITS和0.1 g?L^-1BSA對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)支持，對(duì)心肌細(xì)胞貼壁率與凋亡率均不產(chǎn)生明顯影響。

(八) 抗污染措施

除應(yīng)注意無(wú)菌操作等常規(guī)技術(shù)方法外，還應(yīng)特別注意以下幾點(diǎn)：(1)獲取心臟時(shí)避免剪破消化道。比較穩(wěn)妥的辦法是在劍突上一肋處入剪，這樣做不涉及腹腔，也 就減少了污染機(jī)會(huì)。(2)如條件允許，應(yīng)避免乳鼠心肌細(xì)胞與其他細(xì)胞在同一孵箱內(nèi)共同培養(yǎng)，以防止發(fā)生交叉污染。(3)對(duì)于培養(yǎng)心肌細(xì)胞的觀察、照相每次 時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，否則既會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)液pH改變，又能增加污染機(jī)率。

(九) 培養(yǎng)液pH值

提醒：適宜的pH范圍在7.2~7.4之間，配制及使用培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)注意：

1. pH值會(huì)在過(guò)濾后上升0.1~0.3。

2. 培養(yǎng)液中加入血清后pH值會(huì)有降低，降低程度與血清品質(zhì)和含量有關(guān)。

3. 應(yīng)及時(shí)換液。

4. 配制好的培養(yǎng)液不宜長(zhǎng)時(shí)間貯存在4℃。這是因?yàn)榕囵B(yǎng)液中的CO₂會(huì)溢出，使培養(yǎng)液pH上升。每次配好的培養(yǎng)液盡量在2 wk內(nèi)用完，否則應(yīng)部分置于－20℃保存，使用前應(yīng)補(bǔ)充谷氨酰胺和NaHCO₃，再次過(guò)濾后方可使用。