1．細(xì)胞培養(yǎng)

1.1培養(yǎng)基的配置：

⑴ 將一袋培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水（水溫20℃～30℃）到950毫升，輕微攪拌溶解。

⑵ 加入2.438克碳酸氫鈉。

⑶ 輕微攪拌溶解，加注射用水至1升。

⑷ 用1mol / L 氫氧化鈉溶液或 1mol / L鹽酸溶液調(diào)pH至6.8-6.9。

⑸ 用0.2μm濾膜正壓過濾除菌。

⑹ 溶液應(yīng)在2℃－8℃下避光保存。

1.2 胎牛血清的處理：

沒有滅活的血清中含有補(bǔ)體成分，需要將血清在60℃條件下滅活30 min。在水浴鍋內(nèi)進(jìn)行，滅活的過程中，要不停的搖晃，是受熱均勻，防止沉淀析出來。滅活后的胎牛血清分裝后放置-20℃，分裝的目的是為了防止血清的反復(fù)凍融。

1. CHO的復(fù)蘇

1.3.1 預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。

1.3.2 取保存的安倍瓶迅速加入37度水浴鍋中，不斷搖動(dòng)，保證1min內(nèi)解凍。

1.3.3在超凈臺(tái)中加入37度預(yù)熱的DNEN 8mL至離心管中，同時(shí)加入細(xì)胞冷凍液，800rpm離心5min。

1．3.4棄上清加入37度預(yù)熱的DMEM和10%的太牛血清37度5%二氧化碳培養(yǎng)箱中置夜。

1.4 CHO細(xì)胞換液

（復(fù)蘇后的細(xì)胞，一般是在4小時(shí)或是18小時(shí)左右對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行換液）

1.4.1預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。

1.4.2 取出細(xì)胞培養(yǎng)板，用移液器吸出平板內(nèi)的培養(yǎng)基，用PBS或是培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，注意清洗時(shí)把清洗液緩緩延平板邊緣流進(jìn)，防止用力過大吹起細(xì)胞。

1.4.3 加入培養(yǎng)基9ml，加1ml的胎牛血清。

1.4.4 37度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)置夜。

1.5 CHO細(xì)胞細(xì)胞的傳代

培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度之后，由于培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)逐漸消耗、代謝物逐步積累（可見到培養(yǎng)液變黃），而且細(xì)胞的生長(zhǎng)空間也受到限制，就會(huì)影響到細(xì)胞的繼續(xù)生存。這時(shí)就需要分離出一部分細(xì)胞和更新培養(yǎng)液，這一過程就叫做傳代。
1) 懸浮細(xì)胞的傳代
懸浮細(xì)胞可以直接將培養(yǎng)瓶中的液體吸掉，只留下少量，然后加入新鮮培養(yǎng)液即可。 當(dāng)細(xì)胞懸液中碎片或顆粒物較多，感覺到比較臟時(shí)，可以將懸液移到離心管內(nèi)，800rpm離心5分鐘，棄上清，加入約2ml培養(yǎng)液，吹打至均勻，滴加2-3滴至已加入新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。然后置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（擰松培養(yǎng)瓶蓋）。
2) 貼壁細(xì)胞的傳代
(1) 將消化液（胰酶）從冰箱中拿出，放在室溫條件下預(yù)熱；
(2) 吸出全部培養(yǎng)液，沿壁緩緩加入消化液，將培養(yǎng)瓶有細(xì)胞面向下，加入消化液的量至剛好可以覆蓋為止約1ml，輕輕搖晃；
(3) 置于37℃消化2min左右，其間在顯微鏡下觀察，消化至細(xì)胞收縮變圓、部分脫落即可停止消化（加入血清即可停止消化），以防消化過度；
(4) 加入兩到三吸管含血清的培養(yǎng)液，終止消化；用吸管輕輕吹洗培養(yǎng)瓶有細(xì)胞的一面，以使細(xì)胞脫落干凈；
(5) 細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，800rpm離心5分鐘；

棄上清，加入培養(yǎng)液，吹打至均勻，滴加2-3滴至已加入新鮮培養(yǎng)液（約8ml）的培養(yǎng)皿中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代的盤數(shù)根據(jù)細(xì)胞的數(shù)目確定，一般在3-4盤，傳代后的數(shù)目約為10⁴。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)

在操作臺(tái)上取一定量經(jīng)離心過混合均勻的細(xì)胞溶液（約0.5ml）放到小的滅過菌的板上，取出離開操作臺(tái)后加入一定體積的0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染色，取染色好的細(xì)胞培養(yǎng)液慢慢加入到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，要防止計(jì)數(shù)板上有空隙，然后在顯微鏡下數(shù)出細(xì)胞的數(shù)。（一般取對(duì)角的四個(gè)大格或中間的方格然后去平均值*10⁴）。

1.7.  細(xì)胞的凍存
細(xì)胞凍存的原則是要逐步緩慢降溫，以避免細(xì)胞內(nèi)部形成冰晶對(duì)細(xì)胞造成傷害。
1) 貼壁細(xì)胞經(jīng)消化、離心收集，懸浮細(xì)胞經(jīng)離心收集；
2) 大約10⁶個(gè)細(xì)胞加入1ml凍存液（細(xì)胞培養(yǎng)液和10%DMSO），用吸管吹打，使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液；
3) 加入到凍存管中。如用1.8ml的凍存管，每管不要加入超過1.5ml的細(xì)胞懸液；
4) 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱及凍存日期；
5) 用厚布或衛(wèi)生紙包裹凍存管，置于4℃半小時(shí)，然后置于-20℃兩小時(shí)，再置于-40℃兩小時(shí)，然后置于液氮上方置夜；第二天將細(xì)胞置于液氮中；如果僅想提取細(xì)胞內(nèi)的東西可以直接放在-20度的冰箱中。
6) 記下凍存管存放的位置，作好凍存記錄。