總蛋白提取試劑盒 (Total Protein Extraction Kit)

描述：從組織細(xì)胞中提取總蛋白是Western Blot的關(guān)鍵步驟。實(shí)體軟組織如腦脊髓富含磷脂，神經(jīng)血管含大量結(jié)締組織，而脂肪則有大量油脂，常規(guī)的方法難以有效從這些組織提取蛋白。本試劑盒為組織或培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白提取提供完整的解決方案。用裂解-結(jié)合緩沖液勻漿裂解實(shí)體組織，或直接用裂解-結(jié)合緩沖液重懸培養(yǎng)細(xì)胞，然后加入抽提試劑去除非蛋白成分，離心、干燥后即可得到總蛋白。蛋白沉淀溶解后用常規(guī)方法進(jìn)行蛋白定量。提取過(guò)程可在30-60分鐘內(nèi)完成，可在1.5ml離心管微量提取也可大規(guī)模制備，極為簡(jiǎn)便。通常一次提取10-100mg組織所獲得的總蛋白可進(jìn)行幾十到上百次分析如蛋白質(zhì)電泳、Western Blot、免疫共沉淀。

組成  1. 裂解-結(jié)合緩沖液 100 ml               2. 抽提試劑 100 ml

每毫升裂解緩沖液和抽提試劑可提取10-100mg組織或1 ′ 10⁷細(xì)胞。試劑盒的裂解緩沖液是過(guò)量的。

適用  各種實(shí)體軟組織(> 1 mg)，如腦、脊髓、神經(jīng)結(jié)或纖維、脂肪、肝臟、消化道組織、腎臟、

心臟、肌肉、血管、結(jié)締組織等，以及各種原代細(xì)胞和永生化細(xì)胞系。

保存：室溫或4oC保存2年

固體組織蛋白提取

1. 每10-100mg固體組織剪碎后加入0.5-1 ml裂解液，放入玻璃勻漿器內(nèi)上下手動(dòng)勻漿15次；或用高速機(jī)械勻漿器12,000 rpm 破碎組織。注意：初始組織的量應(yīng)在10-100mg范圍。肝腎組織蛋白含量高，提取時(shí)應(yīng)加較少量的組織，否則形成的蛋白膜厚、致密且難溶。少量小的未破碎組織不影響后續(xù)抽提。

1. 僅取0.5ml組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管，棄去剩余的組織勻漿液。每0.5ml組織勻漿液加入2倍體積的(1 ml)抽提試劑充分混勻。室溫或4oC靜置10分鐘，偶爾晃動(dòng)。注意：(1)如組織量<10mg，在下一步離心時(shí)形成的蛋白膜易碎，靜置30min有助蛋白膜形成。(2)提取脂肪組織時(shí)應(yīng)4oC靜置40min以上以充分去除油脂。(3) 0.5ml組織勻漿液獲得的蛋白足以進(jìn)行幾十次Western Blot。保證每0.5ml組織勻漿液加入2倍體積的(1 ml)抽提試劑是成功的關(guān)鍵。

1. 10,000g 4oC離心10分鐘，溶液分為上下兩相，兩相中間為蛋白膜。吸除上層液體；隨后用吸頭或針頭輕輕撥開蛋白膜，吸除下層液體。蛋白膜將附著于離心管壁。注意：(1)離心速度過(guò)高將使蛋白膜過(guò)于堅(jiān)固，難以溶解。(2)如果不能分相，可再加入50ml蒸餾水混勻離心。 (3)如果初始組織量較少(<10mg)，離心后難以得到完整的蛋白膜，此時(shí)可吸去上下層液體，加入1ml純乙醇混勻，10,000g 4oC離心3分鐘。棄所有液體，蛋白沉淀在管底。

1. 敞開管口，室溫10分鐘空氣干燥沉淀。

1. 每100mg組織所得到的蛋白加 200-1000ml用戶自備的緩沖液，95oC煮10分鐘。室溫放置20~60分鐘溶解沉淀。參見后面的說(shuō)明。

培養(yǎng)細(xì)胞蛋白提取

參見固體組織蛋白提取程序中的斜體字注解

1. 消化洗滌并800 g離心收集細(xì)胞。每5-10 x 10⁶細(xì)胞加入0.5 ml裂解液，振蕩重懸，4oC凈置2分鐘。
2. 按比例每0.5 ml裂解液加入1 ml抽提試劑，振蕩混勻。4oC靜置10min。
3. 10,000g 4oC離心10分鐘，溶液分為兩相，兩相中間為蛋白膜。小心吸除上層相和大部分下層相，保留兩相中間的蛋白絮狀物。如果不能分相，可再加入50ml蒸餾水混勻離心。
4. 加入1 ml純乙醇洗滌沉淀。10,000g 4oC離心3分鐘，蛋白沉淀在管底。
5. 去除管中所有液體，敞開管口，室溫空氣干燥沉淀。
6. 每1 x 10⁶細(xì)胞可加入 50-200 ml (或適量)的蛋白溶解緩沖液，95oC煮5-10分鐘，室溫放置20-60 分鐘溶解沉淀。離心除去不溶物。

說(shuō)明

1. 未溶解的蛋白沉淀不含鹽、去垢劑、和還原劑成分。干燥蛋白沉淀可4oC或－20oC長(zhǎng)期保存。
2. 蛋白沉淀溶解步驟：(1)溶解于去離子水或用戶自備的緩沖液，95oC煮10分鐘。室溫放置30~60分鐘或4oC溶解5小時(shí)以上至置夜。12000rpm離心5 min去除任何不溶性沉淀。沒有去垢劑時(shí)沉淀溶解緩慢且某些膜/疏水蛋白不能*溶解。(2)有效的溶解推薦用此法，用2~5% SDS水溶液、或含5%SDS的自備緩沖液，或含2%SDS的標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE凝膠上樣緩沖液，95oC 10分鐘。沉淀量少會(huì)很快溶解。如沉淀很多或過(guò)分干燥，煮沸后4oC溶解5小時(shí)以上或置夜，可溶性蛋白應(yīng)該溶解并釋放到溶液中。4oC溶解置夜的不溶物主要是不溶性成分，通常不含對(duì)實(shí)驗(yàn)有用的可檢測(cè)蛋白。12000rpm離心5 min去除任何不溶性沉淀。但對(duì)于絕大多數(shù)Western Blot目的，按照上述溶解過(guò)程可不加蛋白酶抑制劑，而蛋白不會(huì)有明顯降解。但用戶仍然可以加入蛋白酶抑制劑。注意染色體DNA可與蛋白質(zhì)一起被抽提出來(lái)，溶解時(shí)形成粘稠物。含有大量粘稠DNA的樣品在進(jìn)行電泳時(shí)易導(dǎo)致條帶變形。95oC熱變性、振蕩、注射針頭反復(fù)抽吸有助于*打斷DNA。
3. 蛋白沉淀溶解體積。按照每mg組織2~5ml的比例決定zui終的溶解體積，但需要依據(jù)組織類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康母淖儭＿^(guò)小的溶解體積將使沉淀難以快速有效溶解。樣品中的蛋白濃度也可用每單位體積(ml)內(nèi)的的組織初始重量(mg)或細(xì)胞數(shù)量來(lái)表示，通常這種表示方法與蛋白定量結(jié)果有很好的平行性。
4. 蛋白定量。根據(jù)上述溶解方法溶解，不含染料，稀釋后定量。注意使SDS濃度稀釋到不影響蛋白定量的水平，或選擇不受SDS影響的測(cè)定方法。BCA法<5% SDS濃度，Bradford法<0.125% SDS濃度。
5. 蛋白樣品與2-5′標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE Loading Buffer 混合即可直接上樣電泳。
6. 按比例可進(jìn)行大規(guī)模的組織(～1g)蛋白提取。
7. 提取試劑有刺激性，一旦接觸立即用水清洗。
8. 試劑盒提供的裂解-結(jié)合緩沖液是過(guò)量的。

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