牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)中的作用及產(chǎn)生的常見問題

現(xiàn)代生物技術(shù)包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程，這些技術(shù)的發(fā)展幾乎都與細(xì)胞培養(yǎng)有密切的關(guān)系，特別是在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，細(xì)胞培養(yǎng)更具有特殊的作用。比如基因工程藥物或疫苗在研究生產(chǎn)過程中很多都是通過細(xì)胞培養(yǎng)來實現(xiàn)的，基因工程乙肝疫苗大多是以 CHO細(xì)胞作為載體；基因工程抗體藥物的制備也離不開細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞工程領(lǐng)域更離不開細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，雜交瘤單克隆抗體的研究制備*是通過細(xì)胞培養(yǎng)來實現(xiàn)的，發(fā)酵工程和酶工程有的也與細(xì)胞培養(yǎng)密切相關(guān)。總之，細(xì)胞培養(yǎng)在整個生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起到了很關(guān)鍵的核心作用。細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展，培養(yǎng)基的質(zhì)量是關(guān)鍵，而培養(yǎng)基的構(gòu)成中動物血清對細(xì)胞的生長繁殖起著重要作用。在動物血清中牛血清的應(yīng)用又是zui廣泛的，所以牛血清的質(zhì)量好壞直接影響生物制品的質(zhì)量和安全性。

一、牛血清的主要成分

牛血清是一種成分復(fù)雜的混合物，其大部分成分已為人所知，但還有一部分仍不清楚，而且血清的組成及含量通常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件不同而存在差異。牛血清主要成分有以下幾類：

1 、蛋白質(zhì)類   包括白蛋白、球蛋白、α -巨球蛋白（抑制胰蛋白酶的作用）、胎球蛋白（促進細(xì)胞附著）、 轉(zhuǎn)鐵蛋白（能結(jié)合鐵離子，減少其毒性和被細(xì)胞利用）、纖維粘連素（促進細(xì)胞附著生長）等；

2 、多肽類    主要是一些促進細(xì)胞生長和分裂的生長因子，zui主要的生長因子是血小板生長因子，還有成纖維細(xì)胞生長因子、表皮細(xì)胞生長因子、神經(jīng)細(xì)胞生長因子等，雖然在血清中含量很少，但對細(xì)胞的生長和分裂也起著重要作用；

3 、激素類    激素對細(xì)胞的作用是多方面的。包括：

胰島素：促進細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸，與促細(xì)胞分裂有關(guān)；

類胰島素生長因子：能與細(xì)胞表達(dá)的胰島素受體結(jié)合，從而有胰島素同樣的作用：

促生長激素：促進細(xì)胞增殖的效應(yīng)；

4 、其他成分    如氨基酸、葡萄糖、微量元素等。在合成培養(yǎng)基中這些成分的作用并不明顯，與蛋白相結(jié)合的微量元素對細(xì)胞生長起促進作用。

二、牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的主要功能

牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中用量zui大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細(xì)胞生長必須的營養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。

1 、提供能促使細(xì)胞指數(shù)生長的激素、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或含量微小的營養(yǎng)物，以及某些低分子營養(yǎng)物質(zhì)；

2 、提供結(jié)合蛋白，識別維生素、脂類、金屬離子，并與有毒金屬和熱源物質(zhì)結(jié)合，起解毒作用；

3 、是細(xì)胞貼壁、鋪展生長所需因子的來源；

4 、起酸堿度緩沖液作用；

5 、提供蛋白酶抑制劑，細(xì)胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細(xì)胞不受損傷。

三、牛血清的分類

根據(jù)牛出生時間和血清采制分離方法分為：

1 、胎牛血清：八月齡胎牛心臟穿刺取血；

2 、新生牛血清：出生 12-24小時新生牛靜脈采血；

新生牛血清：采血后靜置自然析出的血清；

標(biāo)準(zhǔn)新生牛血清：經(jīng)離心分離的血清；

       普通新生牛血清：融血或微融血的血清；

3 、小牛血清：出生三月齡小牛動脈采血分離血清；

四、牛血清的質(zhì)量要求

（一） WHO公布的《用動物細(xì)胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求 :

1. 牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家，并應(yīng)具備適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng)。

2. 有些國家還要求牛血清來自沒有用過反芻動物蛋白飼料喂養(yǎng)的牛群。

3.要能證明所用牛血清中不含對所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。

4.血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。

5.無細(xì)菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無大腸桿菌噬菌體污染。

6.要求血清對細(xì)胞有良好的支持繁殖作用。

（二）我國在對牛血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)zui早在 2000年版《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》中提出。包括物理性狀、總蛋白，血紅蛋白、細(xì)菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細(xì)菌內(nèi)毒素，支持細(xì)胞增殖檢查。 2005版藥典頒布之后，小牛血清質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)被納入《中國藥典》 2005年版 第三部生物制品分冊。

（三）美國對牛血清的質(zhì)量要求：

Gibco 和 hyclone等美國主要血清供應(yīng)商的牛血清都已進入到我國市場，他們對血清質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有嚴(yán)格要求，從血清來源到產(chǎn)品質(zhì)量都有明確規(guī)定。

1 、血清來源 ：可從世界各地收集胎牛血清，但必須符合其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和美國農(nóng)業(yè)部進口要求。

2 、血清的收集：必須符合工業(yè)生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)，低溫采集，一次分離，分離后立即混合凍存。

3 、血清的制備：超低 IgG胎牛血清、透析血清、 γ - 射線輻照；

4 、除菌過濾： 0.22 μ m 和 0.1 μ m 濾膜過濾；

5 、成品分裝：根據(jù)需要分裝成不同規(guī)格。

五、牛血清質(zhì)量檢定指標(biāo)

1 、化學(xué)檢定：包括滲透壓（ 240～ 340）、 pH（ 7.0～ 8.0）、總蛋白含量（ 3.5～ 5.0％）、血紅蛋白 （≤ 0.02％）

2 、微生物檢查：細(xì)菌和真菌 ——直接培養(yǎng)法、噬菌體 ——噬斑法和增殖法、支原體 ——培養(yǎng)法和

DNA 染色法 、牛病毒 ——細(xì)胞培養(yǎng)法。要求均為陰性。

3 、內(nèi)毒素檢測 ——凝膠法和動態(tài)濁度法。要求內(nèi)毒素含量≤ 10EU/ml

4 、促細(xì)胞生長測定（ SP2/0-Ag14標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定）

      1 ）zui大增殖濃度≥ 1.0× 106個 /ml、倍增時間≤ 20小時  

         克隆率＝（陽性孔平均數(shù) /培養(yǎng)孔總數(shù)）× 100％

      2 ）貼壁效率（ VERO細(xì)胞、二倍體細(xì)胞等）

        10 ％血清―― 50或 100個細(xì)胞 /孔

        貼壁效率（％）＝（每孔克隆平均數(shù) /每孔存活的培養(yǎng)細(xì)胞平均數(shù)）× 100％

    相對貼壁效率＝被測血清貼壁效率 /參考血清貼壁效率

以上項目檢定結(jié)果應(yīng)符合 2005版《中國藥典》第三部的相關(guān)規(guī)定。血清廠家應(yīng)在此基礎(chǔ)上結(jié)合疫苗病毒生產(chǎn)工藝建立企業(yè)內(nèi)控檢定項目并建立相應(yīng)的檢定方法，保證疫苗病毒生產(chǎn)的穩(wěn)定性，提高疫苗制品的質(zhì)量。  

六、牛血清的使用所產(chǎn)生的常見問題

（一）由于血清營養(yǎng)豐富，貯存條件特殊，因此在貯存和使用過程中容易產(chǎn)生以下問題：

1 、改變培養(yǎng)液的 pH值

牛血清的 pH理論值為 7.0～ 8.0，培養(yǎng)基在加入規(guī)定量的碳酸氫鈉后（即達(dá)到細(xì)胞生長所需要的滲透壓），再加入 10％的牛血清，一般會使培養(yǎng)液的 pH值發(fā)生改變。因此在使用過程中應(yīng)注意 PH的變化，如有必要可用 1mol/LNaOH或 1mol/LHCl調(diào) pH到所需值。

2 、由于血清的營養(yǎng)成分豐富，非常適合細(xì)菌、真菌和支原體等生長。國產(chǎn)血清大部分采用手工分裝，因此容易把微生物帶入而使得血清被污染。使用前如果沒有及時發(fā)現(xiàn)，將會把污染物帶入正在培養(yǎng)的細(xì)胞中，而使得細(xì)胞不能正常生長。

3 、血清在貯存解凍過程中會產(chǎn)生沉淀，這是由于血清中含有大量脂蛋白、纖維蛋白及多肽類物質(zhì)，在 -15℃冷凍保存解凍后就會自然形成沉淀，隨著保存時間的延長，沉淀量會增加。因此在融化血清時一般應(yīng)先在 4 ℃放置使之解凍，然后放在室溫使血清*融化，以避免沉淀的增加。添加血清時應(yīng)避免把沉淀加入培養(yǎng)液，否則由于沉淀的存在會使得所培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生大量黑點，或者細(xì)胞表面將會覆蓋一層油狀物質(zhì)，影響細(xì)胞的正常生長。為減少血清的損失，可以把有沉淀的血清收集起來進行離心處理，將上清液加入培養(yǎng)液使用（一般不建議采用過濾的方法除去沉淀，因為沉淀會堵塞濾膜而無法過濾）。

（二）大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中牛血清對細(xì)胞及病毒滴度的影響

血清是一種成分復(fù)雜的混合物，不同批次血清對細(xì)胞生長的促進作用不同。大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中由血清引起的細(xì)胞生長狀態(tài)不佳及病毒滴度的影響表現(xiàn)在以下幾個方面：

1 、細(xì)胞生長速度緩慢，長滿單層時間長；從同一細(xì)胞瓶中分出兩瓶細(xì)胞，用同一種培養(yǎng)液，分別加入 10％的對照血清和待檢血清，在相同條件下培養(yǎng) 72小時，會出現(xiàn)對照血清長滿單層，而待檢血清大約只有 60～ 70％，這種血清就不適合用來大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞。

2 、細(xì)胞傳代后形態(tài)不正常，細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生變化 ；由于血清的質(zhì)量問題，使原本狀態(tài)正常的細(xì)胞經(jīng)傳代后形態(tài)會變差；比如：細(xì)胞瓶里會出現(xiàn)一些蠕動的小黑點（并非污染），或者細(xì)胞表面形成一層油狀覆蓋物；細(xì)胞的輪廓變得模糊，細(xì)胞之間的間隙被血清中的蛋白顆粒填充，從而影響細(xì)胞向四周擴展生長。

    3 、細(xì)胞傳幾代后就出現(xiàn)脫壁現(xiàn)象，不能連續(xù)傳代 ；質(zhì)量較差的血清缺乏某種細(xì)胞的貼壁因子，會使細(xì)胞在傳代過程中逐漸喪失貼壁的能力。細(xì)胞會從正常的貼壁狀態(tài)，邊緣開始萎縮，上翹。觀察到的現(xiàn)象就是細(xì)胞表面不光滑，晃動細(xì)胞瓶會看到細(xì)胞表面有絮狀物隨培養(yǎng)液波動。隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞萎縮的情況越來越嚴(yán)重，直到zui終*脫壁而死亡。

4 、細(xì)胞長的很好，致密的單層，狀態(tài)也很正常，但是接毒后細(xì)胞基本不發(fā)生病變，做滴度檢測幾乎測不出抗原滴度。這種情況也許是因為血清中含有與接種的病毒有同源的特異性抗體。比如血清中經(jīng)常會存在乙腦抗體，牛腹瀉病毒抗體等，如果存在這些抗體，就會把接進去的病毒給中和掉。如果抗體滴度很高，病毒會被抗體*中和，就沒有病毒顆粒在細(xì)胞中增殖，所以會檢測不到病毒滴度。這種情況給疫苗企業(yè)造成的損失是相當(dāng)大的，不產(chǎn)毒等于前面所做的那么多工作全部白費，浪費人力、物力，尤其是時間上的浪費，從培養(yǎng)細(xì)胞開始到接病毒，到收液至少需要一兩個月，一旦出現(xiàn)不產(chǎn)毒的情況，那么這一兩月時間就白白浪費掉了，這也是牛血清給疫苗企業(yè)造成的風(fēng)險之一。

5 、細(xì)胞生長的狀態(tài)一般，產(chǎn)毒少，毒價低。這種情況比較常見，細(xì)胞是病毒的載體，由于血清質(zhì)量不好，導(dǎo)致細(xì)胞生長狀態(tài)不好，病毒就無法進行正常的復(fù)制。并非所有病毒都不能復(fù)制，所以就造成疫苗的效價不夠，可能造成不合格產(chǎn)品。

（三）牛血清給生物制品帶來的問題

對于使用傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)的大多數(shù)細(xì)胞來說，添加牛血清是*的。但是牛血清的使用也給細(xì)胞培養(yǎng)和生物制品的生產(chǎn)帶來很多問題，并成為生物制品生產(chǎn)水平達(dá)到*化和實現(xiàn)

經(jīng)濟性目標(biāo)的一大障礙。

1 、批間差異  

血清是一種成分復(fù)雜而且不確定的混合物，不同來源的血清成分存在很大的差異，因此支持細(xì)胞生長的效果也有較大差別。而每批血清的批量是有限的，所以換血清批號時要預(yù)先做大量的篩選實驗，以確定對細(xì)胞生長影響zui小的血清。不但增加工作量 ,而且如果因為一時篩選不出合適的血清還會導(dǎo)致生產(chǎn)停滯。

2 、動物來源成分

  因為來源于動物 ,所以有可能攜帶傳染源 ,包括病毒和有毒物質(zhì) ,任何一種傳染源都有可能對正在生長的細(xì)胞系或者制品帶來風(fēng)險；不同來源的血清存在某些特異性病毒抗體（比如：乙腦抗體、牛腹瀉性病毒抗體等），直接影響接毒后病毒的復(fù)制，可能導(dǎo)致不產(chǎn)毒或毒價偏低，從而給疫苗生產(chǎn)造成巨大損失。  

3 、提高生產(chǎn)成本 

目前市場銷售的血清平均價格約 0.25元 /ml,按 10％添加量計算， 1L培養(yǎng)液中血清所占的成本是 25元，培養(yǎng)基及其他添加物的成本約為 6元，每升培養(yǎng)液的成本中血清約占 80％，由此可見血清在疫苗生產(chǎn)中占據(jù)了大量的生產(chǎn)成本。

4 、行業(yè)競爭導(dǎo)致質(zhì)量難以提高  

由于國內(nèi)牛血清生產(chǎn)廠家增多，而用戶的數(shù)量有限。為了獲得客戶資源，很多血清廠家都在進行低價銷售，行業(yè)內(nèi)形成一種惡性的價格競爭。低價格帶來的結(jié)果就是低質(zhì)量的血清。目前很多血清廠家都處于維持生存的狀態(tài)，因此難以投入大量資金和人力來提高血清的質(zhì)量。

5 、血清蛋白引起的疫苗純化問題

由于血清含有大量的不同分子量的未知蛋白和多肽類物質(zhì)，勢必會增加提取 ,分離 ,純化的步驟 ,增加了下游純化處理的難度 ,因此在疫苗純化階段給純化工作帶來很大的困難；疫苗產(chǎn)品中牛血清白蛋白殘留量要求不高于 50ng/劑，為達(dá)到純化的目的，純化工藝不得不添加新的儀器設(shè)備；在除去牛血清白蛋白殘留的同時，也會損失大量的有效目的產(chǎn)物，從而降低了疫苗的產(chǎn)率；牛血清中的某些蛋白與目的產(chǎn)物的分子量接近，在純化過程中不能*被去除，由于血清殘留而導(dǎo)致的生物制品不合格 ,或者因為雜蛋白含量大造成嚴(yán)重不良反應(yīng)的情況時有出現(xiàn) .因此也會嚴(yán)重影響疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量。

6 、相關(guān)法規(guī)對牛血清使用的規(guī)定

    為了使與傳染源相關(guān)的風(fēng)險降到zui低，上存在多個國家之間限制進出口生物材料的法規(guī)；美國、歐盟和日本等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)計劃在 2010年全面停止血清在生物制藥中的應(yīng)用； FDA目前已不受理利用血清進行細(xì)胞培養(yǎng)的新藥申報； FDA與美國農(nóng)業(yè)部已經(jīng)嚴(yán)密控制胎牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)中的使用，瘋牛病和口蹄疫的流行導(dǎo)致對牛血清控制使用更加嚴(yán)密； 2003年 4月， Vera Baumans和 Jan van der Valk組織召開題為 “改進體外培養(yǎng)技術(shù)方法，替換胎牛血清 ”的會議，討論 FBS的使用問題，在范圍內(nèi)號召減少 FBS的使用；因此，預(yù)計政府部門對胎牛血清加工或使用的限制將會更加嚴(yán)厲。

藥品管理法對生物制品的質(zhì)量提出嚴(yán)格要求，尤其是我國加入 WTO之后，在制品的質(zhì)量上要求更嚴(yán)格。產(chǎn)品的市場競爭應(yīng)主要靠質(zhì)量競爭，所以對制品的主要原材料的質(zhì)量要求也會越來越嚴(yán)格。牛血清作為生物制品生產(chǎn)所需的一種原材料，其質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到制品的質(zhì)量和安全性，由牛血清給生物制品帶來的問題也日益凸現(xiàn)。細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及減少動物來源成分在生物制品中的使用已成為今后生物制藥發(fā)展的趨勢，為提高制品的質(zhì)量和安全性，生物制品生產(chǎn)過程應(yīng)盡量降低血清的使用量或?qū)ふ姨娲寮皠游锝M分的原材料。