糖化酶活力測定（直接滴定法）

原理

采用可溶性淀粉為底物，在一定的pH值與溫度下，使之水解為葡萄糖 (還原糖)，以直接滴定法測定。

試劑及儀器

（1） 堿性酒石酸銅鉀溶液（使用時等體積混合甲、乙溶液）： 甲液：稱取15.693g硫酸銅(Cu₂SO₄·5H₂O)，0.05g次甲基藍(lán)，用水溶解并稀釋定容至1000mL； 乙液：稱取50g酒石酸鈉鉀，54g氫氧化鈉，用水溶解并稀釋定容至1000mL

（2） 0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：準(zhǔn)確稱取1g無水葡萄糖（預(yù)先在100-1050C烘干），用水溶解，加5mL濃鹽酸，用水定容至1000mL。

（3） pH4.6乙酸-乙酸鈉緩沖溶液：

0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀釋至1000mL；

0.2mol/L 乙酸鈉溶液：稱取27.2g乙酸鈉（CH₃COONa·3H₂O），用水定容至1000mL；

pH4.6乙酸-乙酸鈉緩沖液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸鈉溶液等體積混合。

（4） 0.1mol/L氫氧化鈉溶液：稱取4g氫氧化鈉，用水溶解并定容至1000mL。

（5） 2%可溶性淀粉溶液：準(zhǔn)確稱取2g可溶性淀粉（預(yù)先于10-105 0C烘干），加少量水調(diào)勻，傾入80mL沸水中，繼續(xù)煮沸至透明，冷卻后用水定容至100mL。

（6） 固體曲

（7） 滴定管、電子天平、燒杯、恒溫水浴鍋、脫脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶

測定步驟

（1） 5%固體曲浸出液制備：稱取5.0g固體曲（以絕干曲計(jì)），置于250mL燒杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸鈉緩沖溶液，攪勻，于30℃水浴中保溫浸1小時，每隔15min攪拌一次。用脫脂棉過濾，濾液為5％固體曲浸出液。

（2）固體曲糖化液的制備：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，于30℃水浴預(yù)熱10min。準(zhǔn)確加入5mL 5％固體曲浸出液，搖勻，立即記下時間。于30℃水浴準(zhǔn)確保溫糖化1小時。迅速加入15mL 0.1mol/L氫氧化鈉溶液，終止酶解反應(yīng)。冷卻至室溫，用水定容至刻度。

同時作一空白液：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，先加入15mL 0.1mol/L氫氧化鈉溶液，然后準(zhǔn)確加入5mL 5％固體曲浸出液，用水定容至刻度。

（3）定糖

空白液測定：吸取堿性酒石酸銅甲、乙液各5mL，置于150mL三角瓶中，準(zhǔn)確加入5mL空白液，并用滴定管預(yù)先加入適量的0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，使滴定時消耗的0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液在1mL以內(nèi)，搖勻。于電爐上加熱至沸騰，立即用0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定至藍(lán)色消失，此滴定操作需在1min內(nèi)完成。

糖化液測定：準(zhǔn)確吸取5mL糖化液代替5mL空白液，其余操作同上。

實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和數(shù)據(jù)記錄

表1 定糖消耗的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖體積

（其中在做定糖的糖化液預(yù)實(shí)驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定糖化液時，沒有滴加標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液時，糖化液在煮沸時由藍(lán)色變?yōu)闊o色，所以我們小組把糖化液稀釋了10倍后再做糖化液的定糖實(shí)驗(yàn)）

計(jì)算與結(jié)果

固體曲糖化酶活力定義：1g絕干固體曲，在30℃、pH4.6、1小時內(nèi)水解可溶性淀粉為葡萄糖的毫克數(shù)。

 分析與討論

  該實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在著誤差，誤差的原因：①我們小組的空白液和糖化液都只是做一次實(shí)驗(yàn)，而沒有做平行實(shí)驗(yàn)，改進(jìn)方法是各做3次平行實(shí)驗(yàn)；②因?yàn)槲覀兊目瞻滓旱味ㄊ怯迷?，而糖化液是?0倍稀釋的，所以也會是結(jié)果不那么，改進(jìn)放法：應(yīng)把空白液也作10被稀釋比較好。