摘要： zui近上海徐匯區(qū)中心醫(yī)院內分泌科發(fā)表了一篇文章關于液相色譜-質譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）和酶聯(lián)免疫法(ELISA)對體內25（OH）D3水平的測定

目的  同時用液相色譜-質譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）和酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測患者體內25（OH）D3水平，分析兩者結果的差異。

方法  隨機選取50例住院患者，對同一血清樣本分別用LC-MS/MS法和ELISA法測定25（OH）D3水平，同時用LC-MS/MS法測定25（OH）D2的水平。

結果 LC-MS/MS法測定的維生素D3的均數(shù)為14.99±6.51ng/mL，酶聯(lián)免疫法測定的均數(shù)為20.91±9.70ng/mL，兩者的相關系數(shù)為0.725（P＜0.01），線性相關方程為維生素D3（LC-MS/MS法）=4.829+0.486×維生素D3(ELISA法)。LC-MS/MS法組25（OH）D3濃度高于20ng/mL的比例17%，酶聯(lián)免疫法組為52%，LC-MS/MS法組的25（OH）D2和25（OH）D3總濃度高于20ng/mL的為24%。25（OH）D2占25（OH）D總量的8.4%。

結論  LC-MS/MS法測定的維生素D3的數(shù)值明顯低于ELISA法，兩者正相關性較高，可經(jīng)方程互換。酶聯(lián)免疫法低估了體內維生素D的缺乏，檢測25（OH）D3的同時需測定25（OH）D2濃度。

關鍵詞：液相色譜-質譜聯(lián)用（LC-MS/MS）；酶聯(lián)免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）；25（OH）D3 ；25（OH）D2

維生素D是一個脂溶性維生素，維持人體內鈣的平衡，與骨質疏松密切有關，維生素D及活性維生素D在骨質疏松的治療中廣泛使用。同時由于維生素D受體在人體的廣泛分布，維生素D的骨骼外效應越來越受到重視，維生素D與受體結合后能增強免疫功能，減少炎癥反應，以及降低細胞增殖、分化和程序性死亡的癌癥風險等等，補充維生素D可以減少糖尿病、高血壓的發(fā)生，有助于預防前列腺癌、乳腺癌、結腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生。因此體內維生素D水平的準確檢測愈發(fā)顯得重要。

 1  材料和方法

 1.1  研究對象

 隨機選取2011年1月~2012年6月期間在我院住院就診的患者50例，年齡（72.76±11.95）歲，并排除惡性腫瘤、甲亢﹑甲減、甲狀旁腺亢進、甲狀旁腺減退、肝硬化、激素服用者。

1.2 方法  

 抽取患者空腹血清，同時用酶聯(lián)免疫法（ELISA）和液相色譜-質譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）測定25（OH）D3，并用LC-MS/MS 法測定25（OH）D2。 25-羥基維生素D檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）為靈敏度5nmol/L，精密度批內分析 CV5.3%~6.7% ，批間分析 CV4.6%~8.7%。液相色譜-串聯(lián)質譜檢測技術（LC-MS/MS）以25羥基維生素D3-氘6和25羥基維生素D2-氘3為內標，分析數(shù)據(jù)由Analyst1.5軟件采集，然后作定量分析處理。采用API 4000串聯(lián)質譜儀（Applied Biosystems Inc.，USA），Analyst 1. 5分析軟件；Shimadzu系列液相色譜儀（日本島津公司）。低、中、高濃度質控的準確度應在85%~115%范圍，精密度CV應在15%以內。

1.3  統(tǒng)計學處理

 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗，并進行pearson相關分析。統(tǒng)計學處理使用SPSS13.0完成。

2 結果

 2.1  液相色譜-質譜聯(lián)用法和酶聯(lián)免疫法的結果比較

 LC-MS/MS測定的維生素D3的均值為14.99±6.51ng/mL，明顯低于酶聯(lián)免疫法測定的數(shù)值20.91±9.70ng/mL，兩者正相關性較高，相關系數(shù)為0.725（P＜0.01），線性相關方程：維生素D3（LC-MS/MS）=4.829+0.486×維生素D3 (ELISA)。以25（OH）D3濃度20ng/mL為界限，高于20ng/mL的LC-MS/MS組為17%，高于20ng/mL的酶聯(lián)免疫法組為52%，LC-MS/MS組的25（OH）D2和25（OH）D3總濃度高于20ng/mL的為24%。

2.2 LC-MS/MS法對體內25（OH）D2、25（OH）D3的檢測

 25（OH）D2的均數(shù)為0.96±3.43ng/mL，25（OH）D2+25（OH）D3總數(shù)的均數(shù)為16.64±7.19ng/mL，25（OH）D2占25（OH）D總量的8.4%。

3  討論  

 維生素D是一類脂溶性的固醇類衍生物，主要有麥角鈣化醇（維生素D2）和膽鈣化醇（維生素D3）兩種，兩者的結構很相似，生理學功能也基本相同。人體獲得維生素D的途徑有兩種，一是從食物中攝取，其中動物性食物中主要是維生素D3，而植物性食物中則主要是維生素D2；二是由皮膚組織內的7-脫氫膽固醇經(jīng)日光中的紫外線照射后發(fā)生光化學反應轉化生成維生素D3。除了深海魚、魚肝油、動物肝臟、蛋黃、牛奶和菌類以外，天然食物中維生素D含量較少，人體所需要的維生素D多數(shù)是通過皮膚合成的[1]。來源于膳食或皮膚組織的維生素D本身并不具有生物活性，必須經(jīng)過兩次連續(xù)的羥化過程才能轉化成為具有生物活性的有效物質。從膳食和皮膚兩條途徑獲取的維生素D與血漿維生素D結合蛋白（vitamin D binding protein, DBP）結合后被轉運至肝臟，在肝臟內經(jīng)25-羥化酶的作用首先轉化成25-羥基維生素D25-hydroxyvitamin D），后者進入腎臟后再經(jīng)過1a-羥化酶的催化生成具有生物活性的1,25-二羥基維生素D（25（OH）D2和25（OH）D3 1,25-dihydroxyvitamin D），并在DBP的載運下，經(jīng)過血液到達靶器官并與細胞上的維生素D受體（vitamin D receptor, VDR）結合而發(fā)揮相應的生物學功能。血液中維生素D的半衰期僅為5~7d[2]，只能反映近期從食物中攝取和從皮膚內合成的維生素D的量。而25-羥基維生素D的半衰期卻長達20~30d，是維生素D在血液循環(huán)中的主要存在形式，也是臨床上衡量維生素D營養(yǎng)狀況的主要血液生化指標。

根據(jù)標準,70 歲以上老人每日應攝入維生素D量為600 IU。隨著體內維生素D檢測技術水平的提高和檢測范圍的擴大，近幾年對維生素D的缺乏有了新的認識，據(jù)估計可能有超過10億人缺乏維生素D[3]，在婦女健康啟動計劃（WHI）項目中觀察到美國超過57.1%的絕經(jīng)后婦女維生素D缺乏，其中13%維生素D嚴重缺乏[4]，之類對這部分人群進行的3年隨訪發(fā)現(xiàn)維生素D濃度及飲食攝入量與抑郁癥狀發(fā)生呈負性關聯(lián)[5]。在我國，維生素D的缺乏狀態(tài)也同樣嚴重，無論北方和南方均存在大規(guī)模的維生素D不足，調查顯示北京成年女性運動者平均血清25-羥基維生素D 14.4ng/mL,不運動者12ng/mL[6]，在冬季的上海市區(qū)絕經(jīng)后婦女平均血清25-羥基維生素D為17.1ng/mL,存在較嚴重的維生素不足占30%，維生素缺乏者占調查人口的68%[7]。

目前電化學發(fā)光免疫測定法（ECLIA）、稱液相層析（high performance liquid chromatography，HPLC）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、放射免疫分析法（RIA）是測定25-羥基維生素D3的較常用的方法，國內文獻報道以RIA和ELISA居多，不同的測定方法得到的數(shù)據(jù)有一定差距，會影響到對人群維生素D3缺乏的判斷。據(jù)2010年Johannes分別用Roche ECLIA法、DiaSoria RIA法和LC-MS/MS法3種方法對120例患者血清的25（OH）D3測定，DiaSoria RIA=0.975 (95%Confidence Interval{CI}:0.919–1.031 )×LC-MS/MS+3.02(95%CI:-0.42-6.46) ;Sy/x=8.01;r2=0.90；Roche ECLIA=0.948x（95%CI:0.830-1.067）×LC-MS/MS+13.01 (95%CI: 5.76-20.26); Sy/x=16.90; r2=0.58。LC-MS/MS 與RIA的結果十分接近，與ECLIA的結果相差較大[8]。而LC-MS/MS與ELISA對25-羥基維生素D3的測定比較未見報道，酶免疫分析法主要的缺陷是抗體之間的交叉反應導致的方法特異性不足，而色譜分析法可對這些分析物進行有效分離，從而獲得足夠的特異性，LC-MS/MS法的高選擇性、特異性和敏感性有很大的優(yōu)勢，同時LC-MS/MS能對體內25（OH）D2的濃度進行檢測，25（OH）D2占體內維生素D總量的10%左右，其zui終轉化成1,25（OH）D3發(fā)揮作用，故25（OH）D2的含量也不應忽視。本次研究通過對同一血清標本的檢測，LC-MS/MS測定的25（OH）D3濃度明顯低于酶聯(lián)免疫法，國外目前傾向于用LC-MS/MS法更地反映體內維生素D的含量。

LC-MS/MS能準確地測定體內25（OH）D的含量，可分別測定25（OH）D3和25（OH）D2 。我國人群中的維生素D缺乏率可能有所低估，補充維生素D有廣闊的前景。

[參考文獻]

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[2]  Zeitz U, et al. Impaired insulin secretory capacity in mice lacking a functional vitamin D receptor. FASEB J, 2003, 17(3): 509-511.

[3]  Holick MF. Vitamin D deficiency. N Engl J Med, 2007,357(3): 266-281.

[4]  Millen AE, et al. Predictors of serum 25-hydroxyvitamin D concentrations among postmenopausal women: the Women's Health Initiative Calcium plus Vitamin D clinical ISAl. Am J Clin Nutr, 2010,91(5): ,1324-1335.

[5]  Elizabeth BJ, et al. Vitamin D intake from foods and supplements and depressive symptoms in a diverse population of older women. Am J Clin Nutr, 2011,94:1104-1112.

[6]  Foo LH, et al. Relationship between vitamin D status, body composition and physical exercise of adolescent girls in Beijing. Osteoporos Int, 2009, 20(3): 417-425.

[7]  ZHANG Hao , HUANG Qirenet , et al. Vitamin D status of Shanghai postmenopausal women in winter. CHINESE JOURNAL OF OSTEOPOROSIS. 2011, 2011, 17(1):43-46

[8]  Johannes MW, et al. Measurement of 25-OH-vitamin D in human serum using liquid chromatography tandem-mass spectrometry with comparison to radioimmunoassay andautomated immunoassay. Journal of Chromatography B, 2010,878:1163-1168.