目前，細(xì)胞凍存zui常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護(hù)劑的緩慢冷凍法凍存細(xì)胞。細(xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下直接冷凍，細(xì)胞內(nèi)外的水分會很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應(yīng)。如細(xì)胞脫水使局部電解質(zhì)濃度增高，pH值改變，部分蛋白質(zhì)由于上述原因而變性，引起細(xì)胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)紊亂，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使成分造成破壞，線粒體腫脹，功能丟失，并造成能量代謝障礙。胞膜上的類脂蛋白復(fù)合體也易破壞引起細(xì)胞膜通透性的改變，使細(xì)胞內(nèi)容物丟失。如果細(xì)胞內(nèi)冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細(xì)胞核DNA空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷，而致細(xì)胞死亡。因此，細(xì)胞冷凍技術(shù)的關(guān)鍵是盡可能地減少細(xì)胞內(nèi)水分，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對水的通透性，且對細(xì)胞無明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少胞內(nèi)形成冰結(jié)晶的機(jī)會，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。

常用冷凍設(shè)備和材料

常用的細(xì)胞冷凍貯存器為液氮貯存器，規(guī)格有35L3和50L3兩種。使用時要注意以下幾點(diǎn)：

（1）一般兩周需充液氮一次，至少一個月充氮一次。液氮溫度達(dá)-196℃，使用時注意勿讓液氮濺到皮膚上，以免引起凍傷。

（2）液氮容器為雙層結(jié)構(gòu)，中間為真空層，瓶口有雙層焊接處，應(yīng)防止焊接部裂開。

（3）在裝入液氮時，要注意緩慢小心，并用厚紙卷筒或特制漏斗作引導(dǎo)，使液氮直達(dá)瓶底，如有液氮灌注裝置則更好。若為初次使用，加液氮時更要緩慢，以免溫度驟降而使容器損壞。

細(xì)胞凍存時常備的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培養(yǎng)液，DMSO（分析純）或無色新鮮甘油（121°C蒸氣高壓消毒），2mL安瓿（或細(xì)胞凍存管）、吸管、離心管、噴燈、紗布袋（或凍存管架）等。