實(shí)驗(yàn)原理

凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)zui初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動(dòng)得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測(cè)如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液。在檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白時(shí)，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來(lái)確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競(jìng)爭(zhēng)的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來(lái)確定特異結(jié)合。 

實(shí)驗(yàn)試劑

重要試劑：

Boitin-N4-CTP           (invitrogen    # 15918-18)

TdT                          (NEB        # M0252L)

Poly(dI.dC)               (sigma       ＃P4929)

Hybond-N 尼龍膜       (Amersham   ＃RPN303B)

發(fā)光底物                    (寧波    唯奧)

緩沖液：

Buffer A  (store at 4℃)

Hepes  (pH7.9)                  10mM

KCl                                    10mM

EDTA                                0.1mM

DTT(fresh added)                 1mM

PMSF(fresh added)            0.5mM

Buffer B (store at 4℃)

0.5M EDTA in PBS (pH7.4)

Buffer C  (store at 4℃)

Hepes  (pH7.9)                 20mM

NaCl                                  0.4M

EDTA                                 1mM

DTT(fresh added)                1mM

PMSF(fresh added)              1mM

Buffer I  (store at RT)

Tris (pH7.5)             0.1M

NaCl                           1M

MgCl₂                       2mM    

Buffer II (pH7.5) (store at RT)

馬來(lái)酸                     100mM

NaCl                       150mM

Buffer III  (store at RT)

Tris(pH9.5)              100mM

NaCl                        100mM

MgCl₂                        50mM

Blocking Buffer (store at 4℃)

0.3％Tween-20, 0.3%Triton X-100, 5%BSA in Buffer I

Wash Buffer

0.3％Tween-20 in Buffer II

20×SSC (1L  pH7.0)

NaCl                 175.3g

檸檬酸鈉              88.2g

10×Binding Buffer (store at -20℃) [在公司（碧云天）購(gòu)買：5×binding buffer,內(nèi)含Poly(dI.dC)]

Tris (pH7.5)                  0.1M

KCl                               0.5M

DTT                            10Mm

Poly(dI.dC) (store at -20℃)

1mg/ml in  TE (pH7.5)

SA-HRP(儲(chǔ)存液store at -20℃ 工作液store at 4℃)

1mg/ml in  50%PBS (pH7.2) 50%Glycerin

5×TBE  (5L)

EDTA                         18.612g

硼酸                       139.1175g

Tris                         272.565g

5×TdT Reaction Buffer (store at -20℃) (pH7.2)

Sodium cacodylate              0.5M

CoCl2                               10mM        

TCEP                                  1mM

Biotin-N4-CTP (store at -20℃)

Biotin-N4-CTP               50mM

Tris (pH7.5)                  10mM            

EDTA                              1mM

實(shí)驗(yàn)步驟

生物素標(biāo)記探針:
1. 按如下順序加入反應(yīng)物，溫和混勻，切勿渦漩    

超純水                                   25μl

5×TdT Reaction Buffer           10μl

探針(1μM)                               5μl

Biotin-N4-CTP                         5μl

TdT (2U/μl)                             5μl

37℃反應(yīng)30分鐘

2. 加入2.5μl 0.2M EDTA終止反應(yīng)；

3. 加入50μl 酚：氯仿，短暫渦漩，15000g離心2min，保留上層水相，－20℃保存；

4. 結(jié)合反應(yīng)前等體積混合兩條標(biāo)記引物，90℃退火引物，并自然冷卻至4℃，待用。

抽提核蛋白：

1. 2~3×10⁶密度鋪60mm細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)約12h；

2. 移去細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗細(xì)胞一次；

3. 加入1mL Buffer B 于培養(yǎng)板，將細(xì)胞刮下收集于1.5mL離心管；

4. 1000g 離心2min，吸去上清；

5. 加入160μl Buffer A，重懸沉淀，冰育20min；

6. 加入含2.5％NP-40的Buffer A，渦漩10s，4℃ 15000g 離心5min；

7. 吸去上清，加入40μl Buffer C，4℃渦漩25min，4℃ 18000g 離心5min；

8. 吸取2μl上清采用Bradford法測(cè)蛋白質(zhì)濃度，其余儲(chǔ)存于-80℃。

配置非變性聚丙烯酰胺凝膠(以6％濃度為例)

5×TBE                         1mL

30％Ac-Bi                     2mL

40％Glycerin（甘油）   625μL

DDW （雙蒸水）      6.125mL

10%AP                      150μL

10%TEMED                100μL

以預(yù)冷為4℃的0.5×TBE為電泳緩沖液，100V預(yù)電泳30-60min（時(shí)間不定，跑到溴酚藍(lán)占整塊膠的三分之二處）

EMSA（參考PIERCE公司試劑盒）

1. 特異性的證明

使用的探針序列需證明其是否與目的蛋白特異性結(jié)合，確定目的條帶的位置。

按照“步驟”中的體系，做以下四組平行結(jié)合實(shí)驗(yàn)：

（在加入ddw，10×binding buffer，Poly(dI.dC)的基礎(chǔ)上)

 1) 生物素標(biāo)記的探針

 2) 蛋白質(zhì)粗提物

 3) 蛋白質(zhì)粗提物＋200倍濃度的非標(biāo)記的同種探針（即冷探針）

 4) 蛋白質(zhì)粗提物＋200倍濃度的非標(biāo)記的突變探針（可以設(shè)計(jì)多種突變類型的探針，看是否能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合）

 5) 蛋白質(zhì)粗提物＋抗體

室溫反應(yīng)10min，然后加入生物素標(biāo)記的探針；

室溫繼續(xù)反應(yīng)20min，做EMSA檢測(cè)。

結(jié)果分析，如果出現(xiàn)如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1) 顯示游離探針位置

2) 顯示游離探針位置和遷移帶位置

3) 只有游離帶，沒(méi)有遷移帶

4) 和2)帶型一致

則證明探針與目的蛋白為特異性結(jié)合。

步驟：

1. 按如下順序加入反應(yīng)物，溫和混勻（20μl體系）

    ddw                             ――

    10×binding buffer         2μl

    Poly(dI.dC)                   1μl    （以上文字已說(shuō)明由公司定）

    核蛋白粗提物                  4－10μg（溫和混勻）

    生物素標(biāo)記的探針            0.5μl

室溫反應(yīng)20min，加入6×Loading Buffer (TAKARA) 4μl，上樣10－20μl，100V電泳至溴酚藍(lán)于三分之二處。

2. 電轉(zhuǎn)前將尼龍膜浸泡于0.5×TBE至少10min

以預(yù)冷的0.5×TBE為電轉(zhuǎn)緩沖液100V轉(zhuǎn)膠于尼龍膜上，45min。

3. UV BOX下，以貼近膜一面面向紫外光源，以254nm激發(fā)光交聯(lián)15min（紫外交聯(lián)儀1200能量，照2次）

4. 加入25mLBlocking Buffer，以約70rpm在脫色搖床上封閉30min

5. 將SA-HRP以1:30000-50000稀釋于12mL Blocking Buffer，脫色搖床70rpm作用20min

(洗膜過(guò)程全部在脫色搖床上進(jìn)行, 約100-140prm)

6. Buffer II  25ml,  5min

7. wash buffer 25ml  15min

8. Buffer III  25ml  5min×2次

9. 0.1%SDS in 2×SSC, 5min×2次

10. 0.1%SDS in 1×SSC, 10min×2次

11. 0.1%SDS in 0.5×SSC, 5min×2次

12. 將膜于濾紙稍適吸干，加入到以1:20稀釋的發(fā)光反應(yīng)液(寧波奧唯)，作用1-5 min，將尼龍膜封于保鮮膜中（避免褶皺和氣泡的產(chǎn)生），暗室曝光1-5min，檢測(cè)信號(hào)。

注意事項(xiàng)

使用此protocol效果圖

圖1. 用10ng/ml的mLT-?刺激MEF細(xì)胞，分別刺激0、15、30、60、120min，檢測(cè)NF-?B的量。（p：probe only. 只加入標(biāo)記探針未加入核蛋白抽提物）