ELISA試劑盒程序
(1) 壓跡：根據(jù)樣品的數(shù)量剪取一片硝酸纖維素膜或混合纖維素膜。用直徑3～5mm圓形打孔
器(瓊脂平板打孔器)，在膜的光滑面按順序壓上痕跡，作為點(diǎn)樣部位。將膜置蒸餾水中浸泡，待*浸濕后，取出室溫自然干燥。
(2) 點(diǎn)樣：用微量移液器分別吸取1～2μl(或用玻璃棒、毛細(xì)管蘸一滴)被檢抗原液，滴于
圓圈內(nèi)，自然干燥。為增加抗原吸附量，也可在點(diǎn)樣干燥后，再進(jìn)行第二次點(diǎn)樣。同時(shí)作陰、陽性抗原對(duì)照。
(3) 封閉：將膜置平皿或小池內(nèi)，加入封閉劑，37℃浸泡30～60min。取出稍置片刻，用洗液漂洗2次，晾干。
(4) 與AFMcAb或OFPcAb反應(yīng)：用保溫液對(duì)AFMcAb或OFPcAb作適當(dāng)稀釋，加入反應(yīng)池中，于37℃覆蓋膜2h。
(5) 洗滌：用洗滌液漂洗膜3次，每次3min，晾干。
(6) 與酶結(jié)合物反應(yīng)：凍干辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗BALB/c鼠抗體用保溫液作1∶80稀釋，37℃覆蓋膜1h。
(7) 洗滌：3次，方法同上。
(8) 顯色：將膜浸入底物溶液中，避光染色5～15min。
(9) 終止反應(yīng)：用蒸餾水漂洗濾膜，晾干。
3 結(jié)果判定在陰、陽對(duì)照正常情況下，以在膜圓圈內(nèi)出現(xiàn)棕色斑點(diǎn)為陽性，無色為陰性。膜干燥后，可長(zhǎng)期保存。
在應(yīng)用DELISA試劑盒間接法、雙抗體夾心法等檢測(cè)方法時(shí)，如果膜上包被的是已知的標(biāo)準(zhǔn)抗原或抗體，而不是被檢樣品，為了操作方便，可將上述的“診斷膜”按壓跡剪成小片，置微量反應(yīng)板的小孔中。在微孔中，“診斷膜”與相應(yīng)的被檢樣品和診斷液發(fā)生一系列的抗原抗體反應(yīng)和酶促反應(yīng)。在試驗(yàn)中，被檢樣品和診斷液的用量均為每孔50μl，其他反應(yīng)條件和操作法與常規(guī)ELISA相同。
4 注意事項(xiàng)
1 點(diǎn)樣量不易過大，以免溢出壓跡圈外，造成各樣品混合，如要增加樣品吸附量，可在一次點(diǎn)樣干燥后，再進(jìn)行第2次點(diǎn)樣。
2 膜包被后，一定要封閉確實(shí)，防止抗原或抗體的非特異性吸附，避免膜本底染色過深。
3 結(jié)果判定時(shí)，應(yīng)與陰、陽性對(duì)照斑點(diǎn)反復(fù)比較，ELISA試劑盒盡量克服肉眼觀察所帶來的誤差。