明膠酶譜法試劑盒檢測步驟
1.制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠:推薦分離膠濃度為8%。按照標準程序制備SDSPAGE凝膠。將10×substrateG融化,并90ºC加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10×substrateG并使之稀釋10倍,混勻后加入過硫酸銨和TEMED,等待凝膠聚合。
2.待測樣品1:1稀釋于2×SDS-PAGEnon-reducingbuffer(用完后可自行配制:4%SDS,100mMTris-ClpH6.8,20%glycerol,0.02%bromophnolblue),混合后直接上樣。切勿加熱變性,并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液??赏ㄟ^預試驗確定加樣量,使用普通蛋白預染Marker即可。陽性對照(可選步驟):可取人、小鼠、大鼠或兔100μl全血與100μl2×SDS-PAGEnonreducingbuffer等體積混合,取5-15μl上樣。
3.低電流恒流電泳,每一塊小膠電流為20mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結(jié)束電泳。
4.洗滌凝膠:取出凝膠,去除濃縮膠,放入容器內(nèi)??上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠,然后加入10ml1×BufferA(用蒸餾水稀釋),室溫漂洗凝膠2×30分鐘。中間換液。
5.孵育:倒掉BufferA。加入10ml1×BufferB(蒸餾水稀釋),室溫或37ºC孵育1~5小時。陽性對照或者血中的MMP通常37ºC孵育1小時即可顯示。如MMP活性低,應延長孵育時間為10小時或過夜。
6.顯色:倒掉BufferB,加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液(操作步驟見SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液說明書)。凝膠的大部分區(qū)域被深染,在有MMP條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72(MMP-2)、92(MMP-9)、130(proMMP-9)、225(proMMP-9)kDa
位置出現(xiàn)透明條帶。
7.條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明,但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法:可用非透射光掃描,或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示,并盡量設(shè)置為黑色。MMP條帶則為白色,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。
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