溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗zui為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對(duì)較短。zui為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。
溫育這一步是ELISA測(cè)定中zui容易出現(xiàn)問(wèn)題的步驟。通常目前國(guó)內(nèi)ELISA試劑盒的反應(yīng)溫育時(shí)間為37℃ 30分鐘～1小時(shí)，進(jìn)口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1～2小時(shí)才能有較*的結(jié)合，低于1小時(shí)，可能會(huì)影響測(cè)定下限。要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時(shí)間。一般來(lái)說(shuō)，加完樣本和/或反應(yīng)試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時(shí)，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃，需要一定的時(shí)間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)下，這段升溫時(shí)間可能還比較長(zhǎng)，而在實(shí)驗(yàn)室中，很少有人注意這個(gè)問(wèn)題，通常是將微孔板一放入溫箱即開(kāi)始計(jì)時(shí)，這樣就很容易造成實(shí)際測(cè)定中溫育時(shí)間不夠，弱陽(yáng)性樣本測(cè)不出來(lái)的問(wèn)題。
    除有的ELISA試劑盒儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA檢測(cè)試劑盒板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。
    若用保溫箱，試劑盒應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui后將ELISA試劑盒板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此。ELISA檢測(cè)試劑盒屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。ELISA試劑盒以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。
    這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。無(wú)論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20～25℃，但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求控制溫育。室溫溫育時(shí)，試劑盒只要平置于操作臺(tái)上即可。ELISA檢測(cè)試劑盒應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，在一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。