如果用不同的標(biāo)記物標(biāo)記不同的核酸探針，只要互相不影響各自的雜交反應(yīng)，檢測系統(tǒng)也不相互干擾，雜交信號易于分辨，原則上均能用于雙重或多重標(biāo)記原位雜交。應(yīng)用非放射性標(biāo)記探針的雙重標(biāo)記原位雜交?？煽朔派湫院怂貥?biāo)記探針的分辨率低、時間長以及放射性污染等缺點。

    1．應(yīng)用生物素標(biāo)記探針的雙重標(biāo)記原位雜交  應(yīng)用生物素分別標(biāo)記的兩種探針進行雙重標(biāo)記原位雜交時，雜交反應(yīng)可用含兩種標(biāo)記探針的雜交液一次進行。因為生物素標(biāo)記探針可用辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素檢測(以3―氨基―9―乙基―卡巴唑為底物，陽性反應(yīng)產(chǎn)物為紅色)，而標(biāo)記的探針用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體來檢測(反應(yīng)產(chǎn)物為藍色)，兩個檢測系統(tǒng)互相無干擾，所以，標(biāo)記的親和素抗體也可混合在一起一次孵育。但兩種酶的呈色反應(yīng)需要的pH條件相同，故呈色反應(yīng)需分先后兩次進行。

    2．雙重?zé)晒鈽?biāo)記原位雜交  利用具有不同顏色的熒光素分別標(biāo)記不同的核酸探針，可檢測同一組織或細胞內(nèi)兩種不同的靶核酸。用不同的熒光素作標(biāo)記物進行雙重標(biāo)記原位雜交，有直接法和間接法兩種。直接法將具有不同顏色的兩種熒光素分別標(biāo)記兩種不同的核酸探針，用其做原位雜交，雜交信號能在熒光顯微鏡下通過選擇不同的激發(fā)濾片而直接觀察。此法操作簡便，但敏感性不高。間接法用生物素分別標(biāo)記兩種不同的核酸探針，然后用不同熒光素標(biāo)記的親和素(或抗生物素抗體)抗體來檢測雜交體。間接法比直接法敏感性更高。