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ELISA操作常見問題和解決方法
ELISA即酶聯(lián)免疫吸附實驗，是目前廣泛應用于各種抗原抗體檢測的方法，主要有靈敏度高和特異性強的特點。ELISA操作步驟看似簡單，整個測定過程中卻有諸多影響因素，導致檢測結(jié)果可能與實際結(jié)果偏差較大。為幫助大家分析實驗中常見問題，我們將常見問題的可能原因和解決方法歸納總結(jié)于下表：
問題一：高背景或陰性對照值偏高
可能原因 | 建議 |
陰性對照孔被陽性對照或樣品污染 | 洗滌時，勿將洗液溢出孔外。 |
洗滌不充分 | 確保在洗滌時每個孔都充滿了液體，確保將殘余液體從孔中移除。 |
酶結(jié)合物過濃 | 請檢查酶結(jié)合物是否按說明書規(guī)定稀釋 |
孵育溫度過高 | 檢查孵育箱的溫度是否正確、穩(wěn)定 |
底物在使用前曝光 | 應保存在暗處，避光。 |
讀板前停留時間過長 | 加終止液后3分鐘內(nèi)讀數(shù) |
問題二：陽性對照值偏低或低吸光度
可能原因 | 建議 |
蒸發(fā) | 各步之間，須使用封版膠密封反應板。 |
溫度不均勻 | 校準孵育箱，勿疊放反應板。 |
問題三：邊緣效應
可能原因 | 建議 |
蒸發(fā) | 各步之間，須使用封版膠密封反應板 |
溫度不均勻 | 校準孵育箱，勿疊放反應板 |
問題四：標準曲線不佳
可能原因 | 建議 |
倍比稀釋標準品時未混勻 | 稀釋標準品的每一步均需混勻 |
過早稀釋 | 標準品在快要使用時稀釋 |
加入的體積不正確 | 使用校準過的移液器，快速、等量的將標準品分配到各個微孔中 |
問題五：標準曲標準曲線良好，但樣本無檢測信號
可能原因 | 建議 |
樣本中無檢測物或檢測物含量極低 | 設置內(nèi)參，重新實驗 |
樣本中其他物質(zhì)影響/掩蓋檢測 | 作適當稀釋，降低其他物質(zhì)的干擾，或作系列稀釋，檢測回收率。 |
樣本中檢測物濃度過高，Hook效應導致假低值 | 適當倍數(shù)稀釋樣本，檢測物濃度盡量在試劑盒檢測范圍內(nèi)。 |
問題六：重復性較差
可能原因 | 建議 |
微孔中有氣泡 | 用針尖挑破氣泡 |
試劑未混勻 | 確保充分混勻試劑 |
樣本中有雜質(zhì)或沉淀物 | 使用前離心 |
微孔包被面被吸頭劃破 | 加液時小心操作 |
使用用過的封板膠紙 | 每次須使用新的封板膠封住反應孔 |
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