人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的基本培養(yǎng)方法

復(fù)蘇：

1. 將人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
2. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml 人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC）*培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)，以1000 rpm，離心5 min。
3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的人間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)液2 ml，吹打懸浮。
4. 輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡。
5. 按照人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞說明書中建議復(fù)蘇培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移至一個(gè)T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加入培養(yǎng)液6 ml。
6. 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
7. 復(fù)蘇第二天觀察，如死細(xì)胞較多，更換新鮮的人間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)液，可以使細(xì)胞生長(zhǎng)的更好。

傳代： 
備注1：由于人間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)液是低血清培養(yǎng)液，需要提前取少量人間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)液，額外加入10% FBS，作為胰酶消化終止液使用。 
備注2：細(xì)胞不能太密集，否則容易分化。 

1. 待細(xì)胞長(zhǎng)到70%-80%滿時(shí)進(jìn)行傳代（見備注2），一般3-5天，具體視細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定。
2. 吸除廢液。
3. 用PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。
4. 加入1-2 ml的0.05% 胰酶（含EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng)，使胰酶覆蓋底面，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。
5. 在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞層全部脫落（一般需要1-2 min）。
6. 加2 ml 胰酶消化終止液（即備注1中：額外加入10% FBS的人間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)液）終止消化。
7. 1000 rpm離心5 min，去上清，加入人間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)液2 ml。
8. 多次輕輕吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。
9. 按照1:2-1:3的比例進(jìn)行傳代。
10. 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

凍存：

1. 按傳代的方法將細(xì)胞消化下來，制成細(xì)胞懸液。
2. 以1000 rpm，離心5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，懸浮細(xì)胞。
3. 按每支凍存管內(nèi)加入500 ml細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
4. 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過一夜，轉(zhuǎn)入液氮。

凍存液配方： 
人間充質(zhì)干細(xì)胞*培養(yǎng)液60%，F(xiàn)BS 30%，DMSO 10%