elisa實驗操作中常見問題分析

由于ELISA(酶聯(lián)免疫試驗)具有靈敏度較高、特異性好的特點，已廣泛應用于各種傳染性疾病的篩查如肝炎、愛滋、優(yōu)生優(yōu)育等。雖然洗板只是ELISA實驗重要環(huán)節(jié)中的一個，但作為專業(yè)的洗板機生產(chǎn)廠家，我們必須對影響ELISA實驗結(jié)果各因素有一定的認識。

的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA技術結(jié)果準確可靠的必要條件。如不注意，就易出現(xiàn)白板、花板、色弱和假陽性等現(xiàn)象。尤其是花板現(xiàn)象(就是空白、陰性、陽性對照以及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標本孔的OD值卻明顯偏高)是各個廠家洗板機調(diào)試中經(jīng)常遇到的問題。現(xiàn)將ELISA實驗操作中注意事項總結(jié)如下，以期給大家?guī)硪恍﹩l(fā)，以改善洗板機的安裝調(diào)試水平，提高臨床技術質(zhì)量。

1標本及采集、貯運因素

嚴重溶血，以HRP為標記的ELISA測定中，殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過氧化物酶樣活性，催化底物顯色造成假陽性;混有紅細胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈;如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應;標本凝固不全，有時為了爭取時間快速技術，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果;采血試管洗滌不*、反復使用易交叉污染;塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性。

血清標本宜在新鮮時技術，嚴重溶血標本禁用。一般說來，在5天內(nèi)測定的血清標本可放置于4℃，標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需-20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢吮緫入x心或過濾，澄清后再技術。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次技術，宜少量分裝冰存;使用一次性玻璃試管或真空管采血管;并使用非抗凝標本，肝素抗凝血漿會增加OD值，可能與高濃度肝素具有強大的負電荷能吸附酶標記物不易洗脫有關;EDTA、酶抑制劑(如NaN3)可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性;血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當?shù)拇倌齽?/SPAN>

2、試劑的影響

ELISA診斷試劑經(jīng)歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡。由于歷史的原因，人們往往以反應本底的好壞來衡量ELISA反應試劑盒，因此有些廠家為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學敏感度不夠，穩(wěn)定性也成問題。也有廠家堅持試劑盒高的流行病學敏感度，科學地對待反應結(jié)果?；蚬こ炭乖^合成肽抗原有*的*性，就HCV-ELISA試劑盒來講，*代產(chǎn)品為合成肽抗原，主要是HCV特異性抗原決定簇的肽片段;第二代產(chǎn)品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是當時的基因工程抗原不全，僅包括了HCV的核心區(qū)片段;第三代產(chǎn)品基本上采用了基因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩(wěn)定、純度更高的HCV特異性抗原。第三代試劑的敏感度大大提高了?；蚬こ炭乖c合成肽抗原的區(qū)別如下：

基因工程抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點：

a.分子量大。合成肽采用化學方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達到數(shù)百個氨基酸;而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。

b.穩(wěn)定性好。包被的抗原的穩(wěn)定性可使試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被抗原的試劑盒效期只有3-4個月，采用基因工程抗原后效期大大延長了。

c.基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達，表達產(chǎn)物包含更多的抗原決定簇，可提高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。

d.純化難度大?；蚬こ炭乖募兓夹g難度較大。

合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特點：a.分子量太小;b.一般只含有一個抗原決定簇;c.純度高;d.穩(wěn)定性差。

國內(nèi)乙肝兩對半試劑廠家較多;不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，資料顯示，不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為89.4%—99.3%,78%—89%存在較大差異。有的廠家酶標板孔間A值差大于15%;標記酶的活性及顯色液的穩(wěn)定比較差。使用質(zhì)劣的試劑必然導致結(jié)果的假陽性或假陰性。因此。選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準確的關鍵之一。

?選擇試劑時應選擇靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性好、批間差小、操作方便省時的優(yōu)良技術試劑，國家參比實驗室每年對各廠家的試劑進行質(zhì)量評估并定期公布評估結(jié)果，可作為選擇試劑的主要依據(jù)。

?要注意試劑的批號和出廠日期，雖然試劑的有效期多為1年。選擇剛出廠的試劑使用。

不同廠家的試劑不能混用。

不同方法學的技術試劑，會使兩對半結(jié)果出現(xiàn)一些不同。例如：在實際工作中常用ELISA技術HBsAg結(jié)果為陰性，而電化學發(fā)光技術為陽性。除方法學的靈敏度外;還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的差別。單抗對變異抗原或亞型乙肝標志物技術存在差異，建議試劑廠家對劑的制備應該考慮亞型及型濃度的問題。

3、操作技術的影響

操作過程的控制：

⑴嚴格按照試劑說明書進行操作。操作前將試劑在室溫下平衡30～60min。

⑵加樣后及時放人孵箱。標本較多時，要分批操作。按說明步驟嚴格控制操作時間，防止孵育時間人為延長，導致非特異性結(jié)合緊附于反應孔周圍，難以清洗*。

(3)封板溫育時，各孔一定要封嚴，防止陽性標本的液體蒸發(fā)，產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導致“花板”的出現(xiàn)。

(4)用洗板機洗板時，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干：還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過程中易產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象而導致“花板”的出現(xiàn)。

(5)合理安排技術量，以免反應板過多造成洗板等待時間長。

(6)加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干。

(7)顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑不用。

(8)加樣時保持顯色劑不外流;A、B液應避免接觸金屬器械。加終止液時應避免產(chǎn)生氣泡。

(9)應保證C清潔，整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸。以上的措施可以使“花板”降至zui低限度。從而提高技術的特異性。并得到更準確、可靠的實驗結(jié)果。

加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準確性，直接影響技術結(jié)果。由于吸嘴構造特殊，導致清洗困難，加大了交叉污染的機會。建議用一次性吸嘴。加樣器也要經(jīng)常清洗，定期校準。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。

溫浴影響，在建立ELISA方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)物的生成可達。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應，邊上的值會偏高，建議為了客觀的判斷結(jié)果，將質(zhì)控放在非邊緣位置。96孔酶標板結(jié)構特別;易產(chǎn)生邊緣效應，抗原抗體結(jié)合及酶促反應對溫度有嚴格要求，酶標板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異;干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。

洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是zui主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。

洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液，各種試劑盒的洗液不要混用。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。洗液需要稀釋，應按要求稀釋。配制洗液應用新鮮的和高質(zhì)量的純化水，電導率小于1.5μs/cm，洗液如果結(jié)晶應待其融解后配制。手洗條件一致性較差，對結(jié)果影響較大，防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。半自動與全自動冼板機使用不當也會影響結(jié)果，血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機針小孔全阻塞或半阻塞狀態(tài)，造成未結(jié)合標記酶洗脫不*，導致“花板”造成假陽性或假陰性;所以操作洗板機過程中要不時觀察洗板機針孔內(nèi)洗液的通暢狀況，及時糾正，洗板機不用時應用去離子水清冼幾遍。

保證洗板浸泡時間為40秒左右，孔內(nèi)液體被洗板機吸得越干凈洗滌效果更好，手工洗板

4.顯色和比色

TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，至2小時后即可*消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24小時)不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指于測讀ELISA結(jié)果吸光度的光度計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復性、度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可到0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15-30℃，使用前先預熱儀器15-30分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。

測讀A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，*次在zui適波長(W1)，第二次在不敏感波長(W2)，兩次測定間不移動ELISA板的位置，zui終測得的A值為兩者之差(W1-W2)。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

肉眼判斷結(jié)果時，顯色淺不易觀察，影響結(jié)果的準確性，必須使用酶標儀技術，以保結(jié)果一致性。

5.HooK效應影響

隨著ELISA一步法的應用，一些標本中抗原含量過高，產(chǎn)生HooK效應。影響技術結(jié)果，采用同步稀釋測定或使用線性范圍高的兩對半定量法可以減HooK反應的發(fā)生。

6.干擾物質(zhì)的影響

有人認為大約40%的人血清標本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響技術結(jié)果;常見的干擾物質(zhì)有：類風濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導的抗鼠Ig(s)抗體、交叉反應物質(zhì)和其它物質(zhì)等。如RF因子可與標記二抗的FC段法結(jié)合造成假陽性，補體從C1q活化，使一抗和酶標二抗的抗體分子發(fā)生變構，F(xiàn)c的C1q分子結(jié)合點暴露出來，則補體C1q可將二者連接起來造成假陽性，采用56℃30分鐘滅活補體可降低假陽性率，高濃度的AFP(如孕婦)，在儲存過程中可能形成二聚體會導致本底過深影響技術結(jié)果。

7.藥物的影響

價的乙肝免疫球蛋白會與HBsAg形成復合物，影響HBsAg的檢出，所以一些HBsAg陽性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg技術會呈陰性反應，導致乙肝兩對半少見模式的出現(xiàn)，如我們常遇到乙肝大三陽的孕婦，為阻斷乙肝母嬰垂直傳播時，在孕第8、9、10月常規(guī)注射200mg乙肝免疫球蛋白，不僅影響孕婦HBsAg的檢出;而且其所生產(chǎn)的生新兒也常出現(xiàn)HBsAg陰性，HBeAg陽性和HBcAb陽性等少見模式、可能是乙肝免疫球蛋白屬IgG抗體能通過胎盤進入胎兒體內(nèi)與胎兒血液中的HBsAg結(jié)合形成復合物;則新生兒HBsAg技術呈陰性;用0.5M的鹽酸處理標本1小時可提高出率。

為預防乙肝，部分HBsAg陰性人群在接種乙肝疫苗后的1—2周內(nèi)，血清中可檢出HBsAg成份，形成一過性HBsAg陽性，這可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能夠把它檢出;如電化學發(fā)光法，建議接種乙肝疫苗后1個月內(nèi)不應作HBsAg技術。

8.抗原自身因素

融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響。以丙肝診斷試劑盒為例為例，因為包被的基因工程抗原為融合蛋白，包含了來自表達載體的一些序列可以與血清中抗大腸桿菌的因子發(fā)生反應而產(chǎn)生了可疑標本。

少數(shù)HBV感染后外周血中不含HbsAg。HBV感染后絕大多數(shù)感染者外周血中可出現(xiàn)HBsAg，含量在5ng～600μg/ml之間。據(jù)文獻報道，到目前為止在獻血員中所發(fā)現(xiàn)的HBsAg攜帶者zui低含量為0.2ng/ml。含量高者可達2000μg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg測定為陰性，如暴發(fā)性乙型肝炎、HBV的S基因發(fā)生變異等。急性重癥乙型肝炎，肝細胞中以合成HBcAg為主，很少或不合成HBsAg，從而使外周血中無HBsAg。HBV的前S/S基因編碼HBsAg，構成病毒外膜，根據(jù)所帶亞型決定簇的不同分為adw、adr、ayw和ayr。a決定簇具有很高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg疫苗可引起抗HBs應答。如S基因145密碼子變異使得其原來的甘氨酸被精氨酸替代時，可致a決定簇的抗原性發(fā)生改變，使機體產(chǎn)生的抗體對變異株無作用，且可引起HBV感染患者血清中同時出現(xiàn)HBsAg和抗HBs。同時乙肝疫苗接種也不能有效預防此類變異病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的變異有自然變異和逃避免疫變異，變異可發(fā)生在多個部位，而且?guī)滋幫蛔兛赏瑫r存在，這些變異有助于病毒攜帶狀態(tài)的持續(xù)存在。近來，有研究表明，前S1區(qū)丟失突變(氨基酸58～118)是引起HBsAg陰性的HBV感染的重要原因，S啟動子位于前S1，是合成HBsAg的調(diào)節(jié)元件，前S1的丟失突變則會影響S啟動子的功能，進而影響HBsAg的合成。

總之，的試劑，良好狀態(tài)的儀器，排除各種影響因素的干擾和正確的操作是保證ELISA技術結(jié)果準確可靠的必要條件。