細(xì)胞/組織溶酶體粗提分離試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

細(xì)胞/組織溶酶體粗提分離試劑是一種旨在從動(dòng)物細(xì)胞或組織中分離出完整而純化的溶酶體細(xì)胞器的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于動(dòng)物軟組織（肝或腦組織）和培養(yǎng)細(xì)胞的溶酶體的制備。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度俱佳。

技術(shù)背景

溶酶體（lysosome）是一種普遍存在于真核細(xì)胞中的細(xì)胞器，含有酸性水解酶，例如酯酶、淀粉酶、蛋白酶、核酶等，分解各種細(xì)胞殘?jiān)蛷U棄物質(zhì)，包括過多的或破損的其它細(xì)胞器、食物顆粒、吞噬的細(xì)菌和病毒等。其大小為0.5至1.5微米，球圓形，溶酶體內(nèi)pH為5.0左右。溶酶體功能異常會(huì)引起溶酶體貯積癥（1ysosomal storage disorders；LSDs），例如家族性白癡?。═ay-sachs disease）和龐貝氏癥 （Pompe’s disease）。溶酶體細(xì)胞器的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的常用的手段之一。從任何組織或細(xì)胞分離溶酶體的技術(shù)方法基本上采用：*，通過機(jī)械或化學(xué)方法破裂細(xì)胞；第二，通過低速差速離心去除殘?jiān)樾己途薮蠹?xì)胞器；第三，通過高速差速離心獲得溶酶體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的溶酶體。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）                                  毫升
裂解液（Reagent B）                                  毫升
凈化液（Reagent C）                                  毫升
強(qiáng)化液（Reagent D）                                  毫升
分離液（Reagent E）                                  毫升
保存液（Reagent F）                                  毫升
產(chǎn)品說明書                                              1份
                                                 
保存方式

保存凈化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月 

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶或PBS緩沖溶液：用于清理細(xì)胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于細(xì)胞脫離
*細(xì)胞培養(yǎng)液：用于細(xì)胞處理所需的培養(yǎng)基
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
4℃臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞
4℃超速離心機(jī)：用于分離細(xì)胞器成分
DOUNCE勻漿器：用于裂解組織細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)步驟

一、動(dòng)物軟組織溶酶體分離（組織勻漿法）

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升凈化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。（若需要完整版說明書可以直接客服?。?/span>

1．手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定1克組織重量（實(shí)驗(yàn)前使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)） 
2．（選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
3．（選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
4．即刻用刀片切碎組織
5．放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
6．加入xx毫升預(yù)冷的裂解工作液
7．渦旋震蕩5秒，充分混勻
8．即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
9．在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）（注意：參見注意事項(xiàng)8）
10．將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
11．放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
12．小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
13．放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為12000g
14．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒 
15．加入xx毫升預(yù)冷的分離液（Reagent E），混勻
16．置于冰槽里孵育15分鐘
17．放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心15分鐘，速度為25000g
18．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體沉淀物
19．（選擇步驟）加入xx毫升預(yù)冷的保存液（Reagent F）
20．（選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心15分鐘，速度為25000g
21．（選擇步驟）小心抽去上清液
22．加入xx微升保存液（Reagent F），充分混勻
23．即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

二、動(dòng)物軟組織溶酶體分離（化學(xué)處理法）

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升凈化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。（本說明書由上海哈靈生物科技有限公司提供）

1．手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定1克組織重量（實(shí)驗(yàn)前使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)） 
2．（選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
3．（選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
4．移入一個(gè)液氮凍存管
5．即刻放入液氮罐XX
6．次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
7．放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
8．加入xx毫升預(yù)冷的裂解工作液
9．渦旋震蕩5秒，充分混勻
10．在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
11．加入xx微升預(yù)冷的強(qiáng)化液（Reagent D）
12．渦旋震蕩5秒，充分混勻
13．在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項(xiàng)9）
14．加入xx毫升預(yù)冷的保存液（Reagent E），輕輕搖動(dòng)試管混勻
15．放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
16．小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
17．放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為12000g
18．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒 
19．加入xx毫升預(yù)冷的分離液（Reagent E），混勻
20．置于冰槽里孵育15分鐘
21．放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心15分鐘，速度為25000g
22．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體沉淀物
23．（選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的保存液（Reagent F）
24．（選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心15分鐘，速度為25000g
25．（選擇步驟）小心抽去上清液
26．加入500微升保存液（Reagent F），充分混勻
27．即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里