抗腫瘤藥物敏感性檢測實(shí)驗(yàn)方法繁多，大體上分為體內(nèi)和體外兩類方法。各種方法各有其優(yōu)點(diǎn)和局限性，使用某一種方法難以確定藥物抗癌作用，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。本章分別介紹體外抗腫瘤藥物敏感試驗(yàn)及體內(nèi)抗腫瘤藥物敏感試驗(yàn)。其中，體外抗腫瘤藥物敏感試驗(yàn)包括四噻唑藍(lán)法藥物敏感試驗(yàn)、致死細(xì)胞染色法藥敏試驗(yàn)、3 H—TdR摻人法藥物敏感試驗(yàn)、染料排斥試驗(yàn)法、生長曲線測定法、集落形成試驗(yàn)法和三磷酸腺苷生物發(fā)光法。體內(nèi)抗腫瘤藥物敏感試驗(yàn)包括裸鼠移植瘤試驗(yàn)和小鼠腎包膜下腫瘤移植試驗(yàn)。

    腫瘤患者常因腫瘤病因和類型不同以及個(gè)體差異的原因，對化療藥物的敏感性有很大差異。為了減少臨床選擇化療藥物的盲目性，實(shí)行個(gè)體化治療，化療前預(yù)測腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性至為重要。腫瘤細(xì)胞化療藥物敏感性的主要指標(biāo)是細(xì)胞數(shù)量的增減。但是這一指標(biāo)不能顯示細(xì)胞的死亡和存活方面的信息，而用活細(xì)胞數(shù)量的增減來表達(dá)腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性更為恰當(dāng)。目前檢測腫瘤細(xì)胞存活狀況的主要方法為臺(tái)盼藍(lán)拒染法、四噻唑藍(lán)(methvlthiazolete trazoliunl，MTT)法和放射性同位素?fù)饺朔?。臺(tái)盼藍(lán)拒染法由于其指標(biāo)判斷人為因素較多，較少應(yīng)用。而MTT法能客觀、準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的存活狀態(tài)，故較常應(yīng)用。

(一)四噻唑藍(lán)法藥物敏感試驗(yàn)

1．試驗(yàn)原理在正常情況下，細(xì)胞線粒體進(jìn)行三羧酸循環(huán)過程中，琥珀酸脫氫酶能催化琥珀酸脫氫，并氧化成延胡索酸；而MTT可接受脫下來的H+ ，使可溶性的黃色MTT變成難溶性、紫藍(lán)色的沉淀，并沉積在細(xì)胞中，而死的細(xì)胞則無此功能。再用DMSO溶解縈色的沉淀，在酶標(biāo)儀下測定其吸光度A值，即可計(jì)算出存活細(xì)胞數(shù)。該方法具有快捷、方便、靈敏、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，并與臨床治療有較好的一致性。MTT快速比色法已被推薦為抗癌藥物的篩選方法。

2．材料

(1)待檢藥物：待測定的化療藥物。

(2)細(xì)胞：臨床腫瘤細(xì)胞的主要來源是由外科手術(shù)獲取。將切下的腫瘤組織立即放人裝有培養(yǎng)液的無菌凍存管中，4℃保存，12h內(nèi)使用。也可以是體外培養(yǎng)的細(xì)胞株。

(3)試劑：MTT(用pH7．2～7．4的PBS現(xiàn)用現(xiàn)配成5mg／ml MTT，或配好后避光4℃儲(chǔ)存，備用l周)、含10％CS的RPMI 1640培養(yǎng)液(內(nèi)含100 U／ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)、Halaks液、DMSO、O．1％膠原蛋白酶、O．25％胰蛋白酶一O．02％EDTA、HBSS。

(4)器材：無菌的96孔培養(yǎng)板、手術(shù)剪、100目和200目不銹鋼網(wǎng)、培養(yǎng)皿、離心管、加樣槍及槍頭、酶標(biāo)儀等。

3．實(shí)驗(yàn)方法

(1)無菌條件下剔除壞死及非腫瘤組織，用Hanks液沖洗1次。

(2)用下述方法之一將腫瘤組織分散為單細(xì)胞：

1)機(jī)械分散法：充分剪碎腫瘤組織，經(jīng)100目和200目不銹鋼網(wǎng)擠壓過濾，收集細(xì)胞。

2)酶消化分散法：充分剪碎腫瘤組織，首先經(jīng)o．1％膠原蛋白酶37℃下消化20min，再用O．25％胰蛋白酶一O．02％EDTA混合液(1：1)37℃下消化，收集細(xì)胞。

(3)將分散的細(xì)胞懸液加入含100％和75％淋巴細(xì)胞分離液的梯度離心管中，2000r／min離心20min，吸取zui上層(75％分離液的界面上)的腫瘤細(xì)胞。

(4)用Hanks液離心洗滌2次，棄上清液，加入適量培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞。

(5)立即將腫瘤細(xì)胞懸液以每孔103～104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板(200μl／孔)，同時(shí)加入事先確定濃度梯度的各組抗癌藥10μl／孔(對照組加入培養(yǎng)液10μl／孔)。在37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)48～72h(培養(yǎng)時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)的目的和要求)。

(6)每孔加入MTT(5mg／m1)20μl，37℃作用4h。

(7)小心吸棄各孔內(nèi)的上清液，對于懸浮生長的細(xì)胞需1000r／min離心5min，然后再吸棄上清液。每孔加入DMSO 150μl，振蕩，使紫藍(lán)色沉淀充分溶解，用酶標(biāo)儀在波長450～600nm處測定吸光度A值。

(8)各藥物濃度組設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值計(jì)算藥物作用后腫瘤細(xì)胞生長抑制率。

4．結(jié)果分析若實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生長抑制率大于50％，即表明藥物有效。