貼壁生長的IOSE80細胞是用彎口培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶平放（瓶口向上翹），細胞就貼在瓶底內(nèi)壁一層生長。瓶底空間有限，當細胞在瓶底生長鋪滿一層時，由于接觸抑制，細胞會停止分裂而進入老化凋亡的狀態(tài)。理論上將瓶底平面空間擴大，就能讓細胞有更大的空間繼續(xù)生長。在實際操作上，就是把一個瓶的貼壁細胞從瓶底內(nèi)壁“取下來”，再稀釋分裝到X個新的培養(yǎng)瓶，這就相當于把原來的面積擴大了X倍。就是我們習慣上說的“1傳X”。所謂“傳代”就是這個意思，以細胞分裂來說，這樣的“傳代”并不是指細胞由一個變成兩個，而是已經(jīng)經(jīng)過了很多代了。“取下來”的意思不是生刮硬掰，而是用胰蛋

白酶消化液。細胞相互貼住或與瓶壁貼住的機理就是靠細胞表面的蛋白。胰蛋白酶能水解這種蛋白而破壞細胞的粘連，從而消散成團細胞成單個細胞懸液。

操作上：進入無菌室，酒精擦手消毒，無菌風吹干雙手，點燃臺面的酒精燈，培養(yǎng)液和胰酶放到超凈臺上，打開塞子備用。從培養(yǎng)箱中取出一瓶細胞，準備傳代。先準備要用的移液管。一般我是用四根/瓶，兩根5ml的，兩根2ml的。*根移液管（5ml）是用來吸掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊的培養(yǎng)液的，廢液放到廢液缸。然后用一根新的管（2ml）吸取一點胰酶，滴7～8d到瓶中。這時由于還殘留有舊的培養(yǎng)液，而培養(yǎng)液中的血清是會終止胰酶的消化作用的，所以*次加入的胰酶實際上是清洗作用，當然用PBSbuffer也一樣，只是我貪方便。搖動瓶子，清洗完后用原來加胰酶的管把液體吸走。用第三根管（2ml）再吸胰酶，同樣滴加7～8d入瓶，這時胰酶就是消化用的。擰上蓋子，平放，讓胰酶剛剛覆蓋細胞薄薄一層進行消化。時間不能長，1～2分鐘就應(yīng)該可以，搖動培養(yǎng)瓶，看底下白色的一層細胞是否能搖下來，細胞散落隨液體流到瓶底，證明消化成功。準備幾個空的培養(yǎng)瓶，用第四根移液管（5ml）吸取一定的新鮮培養(yǎng)液加到細胞消化好的培養(yǎng)瓶中，吹打幾次，讓細胞散開成單個細胞懸液，分裝到多個培養(yǎng)瓶中。擰上蓋子（不要擰緊，讓二氧化碳進入），放到培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

換液就是去掉舊的培養(yǎng)液，換入新鮮的培養(yǎng)液，操作如上，就是不用胰酶消化。

這過程看似簡單，但卻有很多要注意的細節(jié)。

首先，操作盡量往里。就是說盡量伸進去超凈工作臺一點，因為越是接近工作臺邊緣，細菌飄進的機會就增加，哪怕是有無菌風。

第二，裝培養(yǎng)液的瓶子和裝胰酶的試管打開塞子前要用酒精擦，火上烤干再打開。開口后，開口向操作者傾斜放在架子上。這樣你吸取液體的時候就不用一只手拿著瓶子（試管）了。

第三，永遠不能在開口正上方操作。意思就是說你吸取液體時，培養(yǎng)液瓶或胰酶試管開口保持傾斜，移液管也是傾斜插入瓶內(nèi)。如果開口就垂直向上，你也必須垂直插入移液管，那么手上或吸耳球上就有可能有一兩個細菌垂直掉進瓶內(nèi)。還有，取器材時，手要“繞彎”避免在瓶子開口上方空中經(jīng)過。

第四，吸放一次完成。比如吸掉舊的培養(yǎng)液時一次吸完。如果液體比較多，要分幾次吸時，移液管口不能接觸廢液缸。吸取新鮮培養(yǎng)液到培養(yǎng)瓶時，管口也不能接觸瓶子，要在瓶口吹進去。因為如果接觸到瓶子，管口就可能帶有細胞，如果再放到培養(yǎng)液瓶里面去繼續(xù)吸的話，培養(yǎng)液就會被細胞污染。當然，吸夠新鮮培養(yǎng)液后還要吹打，這時就可以接觸，只要你不再吸培養(yǎng)液的話。

第五，移液管要套上一個吸耳球，套球時要注意，左手拿管，右手拿球套上去。關(guān)鍵是左手拿管的位置。不能拿管口部分，應(yīng)該盡量靠上。

第六，一般移液管使用前要在酒精燈上烤一下，就是所謂“過火”。但切記不能烤得太燙，稍微過一下就行了。

如何判斷該傳代還是換液？

首先，培養(yǎng)液中的紅色是因為加了甲基紅，一般剛配好的時候是偏淡的血紅色的。4℃放置一段時間顏色會加深，這是正常的。放到培養(yǎng)箱中因為二氧化碳的作用會變成橙偏紅色。細胞生長會排出偏酸的代謝廢物而使培養(yǎng)液顏色向黃色轉(zhuǎn)變，如果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液顏色偏黃了，就說明細胞生長旺盛，是時候要傳代/換液了。然后是鏡檢。一般我們會以“滿瓶率”表示。就是細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底壁的多少。剛開始時你必須每天觀察，了解細胞生長的速度。細胞剛開始時不多的話，生長可能就會比較慢，但細胞多起來的話生長就會加快。這符合對數(shù)生長的規(guī)律。一般生長快的細胞鋪滿70％以上就要傳代處理了。這需要一定的經(jīng)驗判斷。

如何判斷“1傳X”的“X”？

參考書上是寫通過細胞計數(shù)調(diào)一定濃度的細胞懸液接種到幾個培養(yǎng)瓶……我覺得比較麻煩，所以我是通過鏡檢觀察“滿瓶率”再加上經(jīng)驗來判斷的。我覺得首先是你要了解細胞生長的速度，根據(jù)你實驗的時間表定一個周期。傳代時控制細胞量以配合你的時間表。例如，我培養(yǎng)的細胞生長較旺盛，所以我自己是定了3天為一個周期。一般70％滿的細胞就1傳3，三天后剛好又長到70％滿多一點。每次多一點，到了三四次就會由原來的70％滿變成90％滿，這時就1傳5或6，控制下來。