人鼻咽癌細胞株 貼壁細胞消化方法

一、酶消化法。

1、胰酶。這是用得zui多的。一般濃度在0.25-0.5%。作用時間根據(jù)細胞種類、作用溫度等因素而變化很大，從幾分鐘到幾十分鐘不等。0.25%的胰酶作用于單層貼壁的細胞，在37度條件下，一般消化1-5分鐘就足夠了。終止是用血清。主要作用于細胞間。配制時不能用含鈣、鎂的平衡液，否則影響活性。保存于-20度。

2、膠原酶。這種方法比較少，一般是用原代培養(yǎng)時，從組織消化下細胞。這種方法作用溫和，對細胞損傷較小，但是，價格也較貴。中止同樣是用血清。

二、離子螯合劑：不破壞細胞表面分子，僅與CAMs螯合，因此，如果檢測細胞表面分子的話，盡量，甚至是一定不要用酶消化法。

1、EDTA。用得也是非常多。一般濃度在0.02%左右。作用于細胞與間質(zhì)，對細胞間也有一定作用。注意，它能顯著影響pH值，而且在弱堿性條件下才易溶。因此，配制時應(yīng)調(diào)節(jié)好酸堿度。它不能被終和。因此，消化下來的細胞要洗一遍。

2、商品化的無酶消化液。個人的使用經(jīng)常覺得對細胞的損傷比較大，但是分離成單細胞懸液的能力確實比較強。

三、物理法。直接吹打或用細胞刮子將細胞刮下來。

四、冷凍法。此方法僅能用于細胞傳代時。無法使組織上的細胞脫落下來。本方法的原理，我想是因細胞冷凍后收縮，從而從培養(yǎng)瓶上脫落下來。優(yōu)點是：對細胞損傷小，不需要中止或洗細胞，方便，不需要另外配制消化液。特別適用那些貼壁不是特別緊，又特別嬌氣的細胞。不足是細胞常成小片脫落。此種方法曾用于因用其它方法傳代導(dǎo)致大量細胞死亡操作的間充質(zhì)干細胞、DC細胞的培養(yǎng)，效果非常滿意。具體過程是：1、用較多的4度的PBS洗滌一遍細胞(以6孔板為例，加1.5ml/孔)，2、再加0.5ml 4度的PBS，靜置操作臺上，很快細胞就小片脫落，3、輕輕吹打，細胞即*脫落，4、按一定比例傳代。

細胞消化難題：

1，先用PBS把細胞洗兩遍，使瓶內(nèi)沒有血清了，減少對胰酶的中和，然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然后可以在細胞有些消化下來時，拿著瓶口，運用手腕的力量輕輕震蕩瓶內(nèi)液體，這樣細胞很快就下來了，還不需要吹打，分散也均勻

2，成團、絮狀：

消化液里加入edta可以減少細胞成團的現(xiàn)象，血清可以終止胰酶的作用，如果是進口血清的話也能終止edta的作用。用胰酶消化后胰酶可以倒掉，也可以不倒，直接加血清終止，如果消化液中加入了edta的話，就要將消化液倒干凈，如果細胞貼壁要求不是很嚴(yán)格的話，一般不需要進行離心。

生物試劑銷售中心細胞庫熱賣產(chǎn)品-人鼻咽癌細胞株（HNE1、HNE1/DDP耐藥株、HNE2、HNE3、HONE1、CNE1、CNE2、HK-1、CNE1-lmpl）。這種細胞的貼壁能力很強，用0.5%胰酶(含0.1%EDTA)一般要消化12~15min。用PBS洗滌時要洗凈殘余的培養(yǎng)基，加入胰酶后在培養(yǎng)箱中消化(避免細胞室溫下受損以及在此溫度時胰酶活性zui強)至細胞收縮變圓(可顯微鏡下觀察)且有少許細胞脫落(有流下來的趨勢)，隨后立即棄去胰酶(如果脫落的細胞很多且需要大量細胞實驗，則不能棄去胰酶)，加入培養(yǎng)基仔細吹打(不能用無血清培養(yǎng)基或者PBS替代，否則細胞聚集成團塊或絮狀)。一般我都離心一次棄去上清(去除殘留的胰酶及漂浮的死細胞或細胞碎片)。

消化過度

馬上用培養(yǎng)基中和，用吸管吹打細胞，收集全部的細胞到以無菌的離心管中800RPM 3分鐘。棄上清，用全培重懸，換新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)!!狀態(tài)不好的細胞在培養(yǎng)的過程中會死亡脫落，在換液的時候可以清除掉!!

貼壁細胞消化傳代時通常采用兩種方法：

一、加入胰酶等細胞脫落后，再加培養(yǎng)基中止胰酶作用，離心傳代;二、加入胰酶后，鏡下觀察待細胞始脫落時，棄胰酶，加培養(yǎng)液分瓶。但前者太麻煩，而后者有可能對細胞施加胰酶選擇，因為總是貼壁不牢的細胞先脫落，對腫瘤細胞來說，這部分細胞有可能是惡性程度較高的細胞亞群。

一種簡單的消化傳代方法。加入PBS洗去血清或加入胰酶先中和血清的作用(30s)，棄之，再加入適量胰酶作用10s-40s(根據(jù)細胞消化的難易程度)，棄之，這樣依賴殘余的胰酶就可將細胞消化單細胞。

對于較難消化的細胞，可以用2%利多卡因消化5-8分鐘，然后再棄去，加培養(yǎng)基吹打也可以，對細胞的影響不大。

不用PBS也不用Hanks洗，只要把舊培養(yǎng)液吸的干凈一點，直接加酶消化應(yīng)該不會有什么問題。

棄培養(yǎng)液后，用0.04%的EDTA沖洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室溫孵育5min，棄取大部分EDTA，加入與剩余EDTA等量的胰酶(預(yù)熱)總體積1/10v。消化到有細胞脫落。不過有人說EDTA對細胞不好，有證據(jù)嗎?

培養(yǎng)的BASMC：倒掉舊培養(yǎng)液加入少量胰酶沖一下，倒掉再加入0.125-0.25%胰酶約6-10滴或1ml(25ml bottle)消化再加入適量新培養(yǎng)基中和，并分瓶這種方法簡單、省事;效果很好并且不損失細胞!