杰輝生物與您分享抗血清的制備方法

有了質(zhì)量好的抗原，還必須選擇適當(dāng)?shù)拿庖咄緩?，才能產(chǎn)生質(zhì)量好（特異性強(qiáng)和效價(jià)高）的抗體。

（一）用于免疫的動(dòng)物

作免疫用的動(dòng)物有哺乳類(lèi)和禽類(lèi)，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實(shí)驗(yàn)室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動(dòng)物種類(lèi)的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動(dòng)物反應(yīng)良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清，用于免疫的動(dòng)物應(yīng)適齡，健壯，無(wú)感染性疾患，為///雄性，此外還需十分注意動(dòng)物的飼養(yǎng)，以消除動(dòng)物的個(gè)體差異以及在免疫過(guò)程中死亡的影響。若用兔，用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以2～3kg為宜。

（二）免疫途徑

免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，每點(diǎn)注射0.1ml左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。

（三）佐劑

由于不同個(gè)體對(duì)同一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱，因此常常在注射抗原的同時(shí)，加入能增強(qiáng)抗原的抗原性物質(zhì)，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱(chēng)為免疫佐劑。

佐劑除了延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生。

常用的佐劑是福氏佐劑（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調(diào)整為1：2～9（V/V），這是不*福氏佐劑，在每毫升不*佐劑加入1～20mg卡介苗就成為*佐劑。

配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4℃下保存?zhèn)溆谩Ｃ庖咔叭〉热莘e*或不*佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，滴于冰水上5～10min內(nèi)*不擴(kuò)散為止。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來(lái)回反復(fù)抽吸，約數(shù)十分鐘后即能*乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。

（四）免疫方法

抗原劑量，劑量為300～500μg，加強(qiáng)免疫的劑量約為劑量為1/4左右。每2～3周加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫時(shí)用不*佐劑，免疫時(shí)皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加強(qiáng)免疫時(shí)不必注射百日咳疫苗。

在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3ml血，制備血清，檢測(cè)抗體效價(jià)（見(jiàn)后）。如未達(dá)到預(yù)期效價(jià)，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿意時(shí)為止（圖2-3）。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí)，即可放血制備抗血清。

（五）抗血清的采集與保存

家兔是zui常用以產(chǎn)生抗體的動(dòng)物，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動(dòng)物以頸靜脈、動(dòng)脈取血，鼠等小動(dòng)物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動(dòng)脈放血，一是頸動(dòng)脈入血，也可心臟采血。取動(dòng)脈或靜脈放血時(shí)，將兔放入一個(gè)特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管擴(kuò)張、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片，快速切開(kāi)動(dòng)脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血。頸動(dòng)脈放血時(shí)，將兔仰臥，固定于兔臺(tái)，剪去頸部的毛，切開(kāi)皮膚，暴露頸動(dòng)脈，插管，放血。放血過(guò)程中要嚴(yán)格按無(wú)菌要求進(jìn)行。

收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下，過(guò)宿（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min。在無(wú)菌條件，吸出血清，分裝（0.05～0.2ml），貯于-40℃以下冰箱，或凍干后貯存于4。C冰箱保存。

（六）抗血清質(zhì)量的評(píng)價(jià)

在免疫期間，不僅各個(gè)不同的動(dòng)物，而且同一動(dòng)物在不同的時(shí)間內(nèi)抗血清效價(jià)、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測(cè)試。只有在對(duì)抗血清的效價(jià)、特異性、親合力等方面作*的評(píng)價(jià)后，才可使用所取得的抗血清。

1．效價(jià) 　
抗血清的效價(jià)，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價(jià)測(cè)定的方法常用的是放射免疫法，此法對(duì)所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類(lèi)）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴(kuò)散等方法測(cè)定。前者測(cè)定的效價(jià)極為。而后者則粗糙得多。

（1）放射免疫法

以不同稀釋度的抗血清與標(biāo)記抗原混合，孵育24h后，測(cè)定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度和為效價(jià)。如某抗血清的結(jié)合率為50%時(shí)的稀釋度為1：15000，則該血清的效價(jià)就是1：15000?？寡宓男r(jià)，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量、孵育時(shí)間，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意。

（2）雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。

球脂板的制備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂*溶解，趁熱用紗布過(guò)濾，待溶液冷卻到65℃左右時(shí)，加入疊氮鈉（NaN3），使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，*凝固后，用打孔器打孔（圖2-4）。*孔內(nèi)加適量抗原（容量為50μl），周?chē)骺變?nèi)分別加入50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，觀察有無(wú)沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度。

2．特異性測(cè)定 　　
抗血清的特異性或稱(chēng)專(zhuān)一性是指抗血清對(duì)相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識(shí)別能力。特異性好就是抗血清的識(shí)別能力強(qiáng)。通常，特異性是以交叉反應(yīng)率來(lái)表示的。交叉反應(yīng)率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。交叉反應(yīng)率一般是用競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線來(lái)判斷的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，計(jì)算各自的結(jié)合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50時(shí)的濃度，按下列公式計(jì)算交叉反應(yīng)率。

S=y/Z×100%

S：交叉反應(yīng)率，y：IC50時(shí)抗原濃度，Z：IC50時(shí)近似抗原物質(zhì)的濃度。

如某抗原的IC50濃度為90Pg/管，而一些近似抗原物質(zhì)IC50濃度幾乎是無(wú)限大，可以說(shuō)這一抗血清與其它抗原物質(zhì)的交叉反應(yīng)率近似零，即無(wú)交叉反應(yīng)，該抗血清的特異性是好的。

3．親合力 　　
在免疫學(xué)中， 親合力是指抗體與結(jié)合抗原體的活度或牢固度。抗體與抗原結(jié)合疏松，結(jié)合后會(huì)迅速解離，稱(chēng)為親合力低，反之，親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小，抗體分子的結(jié)合位點(diǎn)與抗原的決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度決定的。親合力常以親合常數(shù)K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）。在RIA中，K是該抗血清能達(dá)到的zui小檢出量（靈敏度）的倒數(shù)，K=1/[H]，[H]是zui小檢出量，通常，K的范圍在108～1012L/mol之間，也有高達(dá)1014L/mol的。

計(jì)算親合常數(shù)的方法20余種，計(jì)算出的K都不能真實(shí)反映實(shí)驗(yàn)情況，只能作為參考。

（七）免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施

有時(shí)不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進(jìn)之。

（1）免疫動(dòng)物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動(dòng)物的種屬或品系，或擴(kuò)大免疫動(dòng)物的數(shù)量。

（2）抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號(hào)，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進(jìn)提取方法。

（3）制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑，載體、抗原或載體的比例、反應(yīng)時(shí)間等多方面去考慮，并加以改進(jìn)。

（4）所用的佐劑是否合適，乳化是否*，可改用其它佐劑，或加強(qiáng)乳化。

（5）免疫的方法、劑量，加強(qiáng)免疫的間隔時(shí)間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。

（6）動(dòng)物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營(yíng)養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求，動(dòng)物的健康情況是否良好等。