一個合格的質(zhì)粒含有以下組成部分：

復(fù)制起始位點Ori：即控制復(fù)制起始的位點。原核生物DNA分子中只有一個復(fù)制起始點，而真核生物DNA分子有多個復(fù)制起始位點。

抗生素抗性基因：可以便于篩選或檢測，如Amp+ 、Kan+。

多克隆位點MCS：克隆攜帶外源基因片段。

P/E：啟動子/增強子。

Terms：終止信號。

加poly(A)信號：可以起到穩(wěn)定 mRNA 作用。

 如何閱讀質(zhì)粒圖譜：

*步：首先看 Ori 的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）。

第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。

--Ampr   水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性；

--tetr   可以阻止四環(huán)素進入細胞；

--camr   生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性；

--neor(kanr)   氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 使G418（長那霉素衍生物）失活；

--hygr   使潮霉素β失活。

第三步：看多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點，便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標志基因的失活，從而便于篩選。MCS決定了能不能放置目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。

第五步：是否含有表達系統(tǒng)元件，即啟動子－核糖體結(jié)合位點－克隆位點－轉(zhuǎn)錄終止信號，這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體。在克隆載體中加入一些與表達調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達載體。選用哪種載體，要以實驗?zāi)康臑橐罁?jù)。

啟動子：促進DNA轉(zhuǎn)錄的DNA序列，這個DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA分子上可以與RNApol特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄。

增強子/沉默子：增強子為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控序列，其作用與增強子所在的位置或方向無關(guān)（即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用）。/沉默子：負增強子，負調(diào)控序列。

核糖體結(jié)合位點/起始密碼/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖體的兩個結(jié)合位點，對于原核而言是AUG（起始密碼）和 SD序列。

轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的zui后一個外顯子中有一個 AATAAA的保守序列，此位點down-stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly(A）加尾信號。

為什么質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針？那其實是代表兩條DNA鏈，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈 DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上。

如何選擇載體

把目的基因通過基因工程手段送到生物細胞（受體細胞），需要運載工具（交通工具）攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。基因工程所用的vector實際上是用來攜帶目的基因片段進入受體細胞的 DNA。

選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點。如果構(gòu)建的目的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。

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選擇適當?shù)募毎臃N濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預(yù)實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。