大鼠ELISA挑出CpG甲基化位點(diǎn)的新策略
DNA甲基化是基因表達(dá)的一種有效的調(diào)節(jié)器。DNA甲基化主要發(fā)生在富含CG的區(qū)域，所以稱為CpG島。如CpG島位于某基因的啟動子區(qū)域，CpG島的甲基化會顯著降低甚至*沉默該基因的轉(zhuǎn)錄，繼而影響蛋白的表達(dá)。但是，如何決定一個目標(biāo)位點(diǎn)的甲基化是否會影響轉(zhuǎn)錄，是具有挑戰(zhàn)性的。CpG二核苷酸上的DNA甲基化，大鼠ELISA試劑盒是真核生物中被充分研究過的一種表觀遺傳轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。通常，這種形式的甲基化涉及到多個位點(diǎn)，但是單個CpG位點(diǎn)的甲基化也會影響基因的表達(dá)。為了促進(jìn)單一位點(diǎn)甲基化研究的發(fā)展可以選擇優(yōu)化的位點(diǎn)特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。
分裂甲基轉(zhuǎn)移酶，這樣它就再也不能很有效地組裝，然后你用DNA作為模板，在你想要甲基化的位點(diǎn)上，幫助組裝甲基轉(zhuǎn)移酶。因此，你增加了這兩半甲基轉(zhuǎn)移酶的局部濃度，可以化解它們沒有組裝好這一問題。然后，它們可以組裝和甲基化那個位點(diǎn)。大鼠ELISA試劑盒雖然Ostermeier的方法增加了期望CpG位點(diǎn)的甲基化，但仍然有明顯脫離目標(biāo)的CpG甲基化。因此，在的進(jìn)展中，他和Chaikind轉(zhuǎn)向努力降低非特異性DNA甲基化，同時(shí)保持目標(biāo)位點(diǎn)甲基化。
新方法利用一個誘變的質(zhì)粒文庫，這些質(zhì)粒包含N末端M.SssI片段/ZFD熔合的編碼基因和C末端M.SssI片段/ZFD熔合的編碼基因。C末端M.SssI片段，在5個選定的殘基上攜帶隨機(jī)變異推測，這會減少其DNA的親合力，而不影響催化活性。利用位于甲基化敏感的FspI限制位點(diǎn)（兩側(cè)是鋅指結(jié)合序列）的質(zhì)粒中的目標(biāo)CpG位點(diǎn)選擇來自FspI消化的甲基化依賴保護(hù)。大鼠ELISA試劑盒然后增加了創(chuàng)新的一步，利用與眾不同的限制酶McrBC，針對非特異性的甲基化。McrBC可消化包含兩個不同甲基化位點(diǎn)（而不僅僅是一個單一甲基化位點(diǎn)）的DNA，導(dǎo)致在目標(biāo)CpG位點(diǎn)以外的一個或多個CpG位點(diǎn)甲基化的任何質(zhì)粒DNA被消化。FspI和McrBC消化后，核酸外切酶III消化會破壞任何裂開的質(zhì)粒，留下編碼高度特異性M.SssI片段/鋅指熔合蛋白的完整質(zhì)粒，用于另一輪的轉(zhuǎn)換和選擇。