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盤點(diǎn)RACE技術(shù)的幾種類型及特點(diǎn)2021/09/16: 在分子生物學(xué)中，未知基因全長(zhǎng)序列的獲取是研究新基因的重要步驟。當(dāng)我們不清楚目的基因的完整序列時(shí)，獲得未知序列的方法有反向PCR、mRNA差異顯示技術(shù)、基因組減法技術(shù)以及cDNA文庫(kù)篩選技術(shù)等等......背景介紹今天我們來(lái)一起了解一種可從低豐度轉(zhuǎn)錄本中獲得cDNA末端序列的方法—RACE技術(shù)。當(dāng)我們不清楚目的基因的完整序列，只知道其中的一段序列時(shí)，就可以通過(guò)RACE技術(shù)獲得mRNA兩端序列，再與已知序列拼接，從而得到完整mRNA序列。相比其他獲得mRNA全長(zhǎng)的技術(shù)，RACE具有簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)的

搞定內(nèi)參，駕馭 Western blot 已成功一半2021/09/15: westernblot對(duì)絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)新人而言，絕對(duì)是心中痛，一碰就要抓狂。沒辦法,誰(shuí)讓導(dǎo)師發(fā)話了，WB做不好，延畢就是分分鐘的事兒。這還真是讓小伙伴們感嘆道，WB想說(shuō)愛你不容易。那么為了*馴服WB，獲得漂亮且理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，一個(gè)良好的參照體系就絕對(duì)是*的存在。一般而言，良好的參照體系包括：*體重計(jì)（分子量marker）：可確定蛋白條帶對(duì)應(yīng)的分子量大小*光桿司令（空白對(duì)照）：不加一抗和二抗，用于檢測(cè)膜的性質(zhì)的封閉效果*好榜樣（陽(yáng)性對(duì)照）：已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的正對(duì)照，可檢測(cè)抗體的工作效率*打醬油的（陰性

用磷酸化抗體做Western Blot時(shí)，要注意哪些？2021/09/15: 今天給大家分享一下在用磷酸化抗體做WesternBlot時(shí)，應(yīng)該注意些什么。1.警惕內(nèi)部敵人一定要在lysisbuffer中加入蛋白酶抑制劑，還要加入一定量的磷酸酶抑制劑，因?yàn)榻M織或細(xì)胞裂解時(shí)會(huì)釋放出大量磷酸化蛋白的死對(duì)頭——內(nèi)源性蛋白磷酸酶，催化磷酸化蛋白(R-p)的去磷酸化，導(dǎo)致不同于正常生理狀態(tài)的差異。因此，外源性加入蛋白磷酸酶抑制劑，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，維護(hù)蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)，否則即使band壓出來(lái)也會(huì)很淺，結(jié)果也不可信。2.低溫能讓他們緊緊地?fù)肀?duì)方加一抗后最好4度過(guò)夜，低溫能讓

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析2021/09/15: Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析①微笑條帶解析：由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠處理辦法：配膠時(shí)一定要充分混勻，待其充分凝固后再做后續(xù)試驗(yàn)②帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象解析：樣品不溶性顆粒處理辦法：加樣前最好是離心一下樣品③電泳條帶粗（這是個(gè)內(nèi)參β-actin）解析：蛋白樣品沒有濃縮，量太大④條帶出現(xiàn)好多洞洞解析：轉(zhuǎn)膜的時(shí)候沒有把三明治里的氣泡干掉WesternBlot是生物學(xué)上一種非常常用的實(shí)驗(yàn)方法，與之相似的還有SouthernBlot和NorthernBlot。但WB失敗的情況也很

WB的免疫印跡操作分享2021/09/14: ①膜處理（甲醇1min，風(fēng)干（放濾紙上），甲醇1min，水1min）②封閉（用TBST配5%牛奶）1h配搖床③加一抗，牛奶稀釋,所需濃度參考抗體說(shuō)明書，看膜的大小配多少一抗，4°過(guò)夜。④室溫孵育20min⑤0.1%TBST洗10minx3次配搖床（0.1%TBST：tris12.1g，NaCl87.66g，HCl至PH7.6后定容至1L后，加入1ml的TWEEN20）⑥加二抗，牛奶稀釋，一般1:10000，1h配搖床⑦0.1%TBST洗10minx3次配搖床⑧發(fā)光（A液B液等體積混合，孵膜1mi

WB過(guò)程中最重要的環(huán)節(jié)——轉(zhuǎn)膜2021/09/14: ①跑到溴酚藍(lán)距離最下緣25px時(shí)配電轉(zhuǎn)液（tris3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇100ml，定容至1L）②在電轉(zhuǎn)液中剝膠，裁膠，剪膜，膜活化（甲醇1min，去離子水1min，電解液15min）③“三明治”黑板~海綿~三層濾紙~膠~膜（正面朝下，分清左右，與膠對(duì)應(yīng)）~3層濾紙~海綿~白板，夾緊后放入電轉(zhuǎn)槽中。（海綿，濾紙，膜需浸潤(rùn)透，過(guò)程中不能干，趕趕氣泡）④連接電源，一定要注意紅對(duì)紅，黑對(duì)黑，定電流和時(shí)間（150mA，1h，若分子量大于90，再加200mA，2h）具體情況具體分析經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：溴

WB電泳技巧分享2021/09/14: ①清洗玻璃板，去離子水沖，風(fēng)干或烤干（一定要以處女座的精神去嚴(yán)格要求自己把板子洗干凈，相當(dāng)重要）②按說(shuō)明書配膠。先配下膠（分離膠），一般兩塊板配10ml的10%的膠（20~80kDa通用）膠的濃度根據(jù)你所需要跑的蛋白的分子量大小決定,混勻后灌膠，立即用正丁醇或無(wú)水乙醇封，待凝固后倒出正丁醇，用去離子水沖洗，濾紙吸干；③配上膠（積層膠），參考說(shuō)明書，一般兩塊板配4ml的5%的膠，混勻后灌膠，插板,待凝固。（可4°過(guò)夜）④配電泳液（tris3.03g，甘氨酸14.4g，SDS1g，定容至1L）⑤將玻

蛋白樣品的制備與定量2021/09/14: （1）提細(xì)胞蛋白①消化或刮下細(xì)胞至1.5的EP管中，標(biāo)記，10000r離心2min，PBS洗3遍②吸去EP管中PBS，最好用濾紙吸干里面的水分，加適量RIPA裂解液（RIPA裂解液：蛋白酶抑制劑=250:1），如果你想做信號(hào)通路指標(biāo)還得再加上磷酸酶抑制劑（磷酸酶抑制劑：RIPA裂解液=1:1000）③冰上裂解30min~1h，開4°離心機(jī)④4°離心11000r，20min⑤測(cè)蛋白濃度，取上清，加蛋白上清的四分之一體積5x上樣loadingbuffer，煮沸，分裝（蛋白質(zhì)變性）（2）提組織蛋白①研

三天征服Chip的經(jīng)驗(yàn)分享2021/09/13: 在科研界，CHIP無(wú)疑是高冷的女神，在追逐的過(guò)程總是分分鐘虐得體無(wú)完膚，糟心的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更是分分鐘想去“狗帶”。征服CHIP的路上，有多虐心就有多少要注意的地方。慶幸的是，曾得到女神青睞的前輩們積累了不少經(jīng)驗(yàn)。好的經(jīng)驗(yàn)要分享，特地總結(jié)了各位高手們做CHIP的經(jīng)驗(yàn)，在此奉上，希望能助大家一臂之力。染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatinimmunoprecipitation，CHIP）是目前研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的*方法，能夠比較真實(shí)的反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TF與啟動(dòng)子Promoter的結(jié)合情況。其

CO-IP沒有條帶的常見原因和解決的辦法2021/09/13: CO-IP并不容易做，尤其是兩個(gè)蛋白豐度低，相互作用力較弱的時(shí)候。做CO-IP經(jīng)常會(huì)遇到?jīng)]有條帶的問(wèn)題。這里談?wù)凜O-IP沒有條帶的常見原因和解決的辦法，更有獨(dú)門配方獻(xiàn)上。蛋白濃度過(guò)稀絕大多數(shù)情況下，CO-IP沒有條帶是由于蛋白濃度過(guò)稀。裂解產(chǎn)物的蛋白濃度越高越好。但是，有些實(shí)驗(yàn)室喜歡稀釋裂解樣品的蛋白濃度再做CO-IP。其實(shí)，在大多數(shù)情況下要盡可能避免稀釋你的細(xì)胞裂解液。盡量使細(xì)胞裂解產(chǎn)物的蛋白濃度可達(dá)7-8mg/ml左右。這才會(huì)避免發(fā)生沒有條帶的情況。沒有裂解開很多時(shí)候，由于裂解液不夠強(qiáng)烈，

染色質(zhì)免疫共沉淀值得注意的15個(gè)細(xì)節(jié)2021/09/13: 染色質(zhì)免疫共沉淀，又叫Chip（ChromatinImmunoprecipitation）。Chip又正好是英語(yǔ)里面薯片的意思。為了有趣，就叫薯片實(shí)驗(yàn)吧。做薯片做了幾個(gè)月，時(shí)間不長(zhǎng)，但深刻體會(huì)到了魔鬼都在細(xì)節(jié)中和細(xì)節(jié)決定成敗?，F(xiàn)在把值得注意的15個(gè)細(xì)節(jié)總結(jié)如下：1、cellcounting：盡量做到準(zhǔn)確準(zhǔn)確再準(zhǔn)確，否則會(huì)影響input結(jié)果。2、crosslink：甲醛的終濃度是1%，這個(gè)基本所有的protocol上都會(huì)強(qiáng)調(diào)。3、resuspendcellswithSDS:一定要選用小的tip頭，

分享染色質(zhì)免疫共沉淀的方法2021/09/13: 目前，不斷發(fā)展的DNA和蛋白質(zhì)相互作用的方法和技術(shù)已經(jīng)成為研究DNA復(fù)制、重組、修復(fù)和轉(zhuǎn)錄的核心。今天跟大家分享的是花樣百出、拽酷炫的染色質(zhì)免疫共沉淀的方法！染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,CHIP)原理值得注意的是，它是目前*個(gè)研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。在生理狀態(tài)下，把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過(guò)超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來(lái)，以富集存在組蛋白修飾或者轉(zhuǎn)錄調(diào)

ELISA實(shí)驗(yàn)操作中值得關(guān)注的細(xì)節(jié)大盤點(diǎn)2021/09/10: 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）因其具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)中的各種抗原和抗體的測(cè)定。盡管ELISA操作簡(jiǎn)單，但是小實(shí)驗(yàn)里也蘊(yùn)含著大文章，ELISA操作各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)效果影響較大，稍不注意就會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果?，F(xiàn)在就跟大家818應(yīng)用ELISA應(yīng)該了解的一些常識(shí)。ELISA分類及具體過(guò)程一般，ELISA可分為以下四大類：直接ELISA、間接ELISA、夾心ELISA、競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA。其他的ELISA都隸屬于這四類ELISA或由這四類ELISA組合衍生。下面

ELISA實(shí)驗(yàn)中常遇到的問(wèn)題、產(chǎn)生的原因與解決辦法2021/09/10: 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，簡(jiǎn)稱為ELISA。ELISA實(shí)驗(yàn)是一種非常經(jīng)典的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。雖然歷史非常悠久了，但是還是不斷地在臨床和基礎(chǔ)研究中得到應(yīng)用。其主要用于：免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位；研究抗酶抗體的合成；顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)；定量檢測(cè)體液中抗原或者抗體成份。小編總結(jié)了一些經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)。遇到的問(wèn)題，可能的原因，解決方法。供大家參考。問(wèn)題1：陽(yáng)性與陰性不能達(dá)到2.1的比值，陰性顏色太深?？赡艿脑颍宏幮詫?duì)照（也就是陽(yáng)性對(duì)照的除目標(biāo)抗原外的其它成分）中有某種成分與一抗作用。解決的方法：純化抗原除去干擾成

一句話知曉實(shí)驗(yàn)方法怎么選？2021/09/08: 在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室里的玩法，無(wú)非就是用某種特定的刺激物（如細(xì)胞活素）去刺激一些細(xì)胞或組織，讓它們high起來(lái)，然后分析細(xì)胞對(duì)這些外源刺激物的反應(yīng)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)哪條信號(hào)通路被激活或失活，或者什么蛋白被分泌出來(lái)。這里面就有很多種方法，哪種最合適，關(guān)鍵看你要檢測(cè)這個(gè)反應(yīng)的哪個(gè)方面的特性。WB建立蛋白質(zhì)的個(gè)人檔案一個(gè)典型的免疫印跡實(shí)驗(yàn)（WesternBlot，WB）可檢測(cè)信號(hào)通路中某種蛋白質(zhì)的特性、表達(dá)和分布，分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)。但至于蛋白-蛋白相互作用則要用另一種更復(fù)雜的方法，即免疫共沉淀法

免疫組化（IHC）的10大實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)（附臨床上常用免疫組化指標(biāo)）2021/09/08: 1.把要做的切片先分好，做幾個(gè)抗體可分幾盒，不正常組織與正常組織要分開。其余做預(yù)實(shí)驗(yàn)用。2.選擇實(shí)驗(yàn)要做的抗體時(shí)，要結(jié)合他們的正常組織和癌組織的分別表達(dá)率。3.試劑盒的選擇可結(jié)合生物素強(qiáng)弱的情況。如：肝組織生物素含量高，S-P試劑盒生物素含量也高，故不能配合使用。4.每次開始做時(shí)，都必須先清點(diǎn)實(shí)驗(yàn)的必需品是否齊全。想好可能發(fā)生的意外，并先想好補(bǔ)救措施。當(dāng)抗體不夠用的情況下，原先買的抗體最好不要用完，留做可能需要的驗(yàn)證試驗(yàn)。新的抗體要盡量同公司，同批號(hào)。5.烤片（單一或綜合）程度要適情況而定，可中

免疫組化之8大疑難解答2021/09/08: IHC常見的8大疑問(wèn)Q1：冰凍切片和石蠟切片如何取材？Answer:冰凍切片取材可分為兩種情況：1）動(dòng)物灌流固定：如小鼠心臟灌流，首先采用預(yù)冷的1×PBS灌流沖洗直至血液全部放出，隨后灌注4%PFA直至小鼠僵直，而后解剖獲取組織，于4℃、4%PFA中固定1h左右，1×PBS洗5次（30min/次），25%蔗糖溶液脫水12h左右包埋即可。2）直接取材：直接選擇新鮮組織進(jìn)行冰凍切片，此時(shí)不需要進(jìn)行抗原修復(fù)。缺點(diǎn)：切出的片子含水量會(huì)比較多，形成冰晶影響結(jié)果，而且后期的丙酮固定也會(huì)改變細(xì)胞的形態(tài)。石蠟切

免疫組化結(jié)果分析應(yīng)該注意的一些事項(xiàng)和技巧2021/09/08: 很多時(shí)候，我們千辛萬(wàn)苦地染出了一張張漂亮的免疫組化片子。但是卻不知道如何正確地分析，得出理想的結(jié)果。這實(shí)在是一件憾事。其實(shí)，免疫組化結(jié)果分析的protocol教科書和實(shí)驗(yàn)手冊(cè)上面都有。今天主要談?wù)剳?yīng)該注意的一些事項(xiàng)和技巧，并且有獨(dú)門絕招獻(xiàn)上，都是干貨喲。對(duì)照染色和做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候必須設(shè)立對(duì)照組一樣，免疫組化也必須設(shè)立對(duì)照染色。沒有對(duì)照染色的免疫組化結(jié)果是不可信的。對(duì)照一般有陽(yáng)性組織對(duì)照，陰性組織對(duì)照，陰性試劑對(duì)照，自身對(duì)照。一般來(lái)說(shuō)，有一個(gè)陽(yáng)性組織對(duì)照和一個(gè)陰性組織對(duì)照就足夠了。定位抗原表達(dá)必須在特

如何避免掉進(jìn)做免疫組化時(shí)導(dǎo)致非特異性染色的八大坑？2021/09/08: 全國(guó)江山一片紅，這可不是閱兵日的朋友圈，而是在做免疫組化??！好好的一張片子染得臟臟的。一下子整個(gè)人都不好了。這里，總結(jié)出了導(dǎo)致非特異性染色的八個(gè)大坑，以及避免掉坑里的一些做法。皆是獨(dú)門絕技，不要眨眼咯！1、抗體問(wèn)題，真的是一分錢一分貨一抗用多克隆抗體容易出現(xiàn)非特異性染色，建議用高純度，高效價(jià)的針對(duì)更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來(lái)解決。單克隆抗體很貴，不過(guò)結(jié)果真的很好。尤其是背景非特異性染色不會(huì)太深。真是一分價(jià)錢一分貨。一抗過(guò)期也會(huì)造成杯具，所以要注意抗體的有效期。2、抗體濃度過(guò)高/孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

發(fā)高分 SCI，不會(huì)免疫組化（IHC）怎么行？2021/09/07: 相信大家對(duì)IHC一定不陌生，世界那么大，實(shí)驗(yàn)方法層出不窮，但是免疫組化卻是經(jīng)典中的經(jīng)典，想看看別的高大上的技術(shù)？不急，我們先來(lái)復(fù)習(xí)復(fù)習(xí)免疫組化。免疫組化，免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry），是一項(xiàng)利用抗原抗體反應(yīng)，通過(guò)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原，對(duì)蛋白定位，定性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。免疫組化主要用的是組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，組織標(biāo)本包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片。石蠟切片，對(duì)組織形態(tài)保存好，保存時(shí)間也長(zhǎng)，雖然對(duì)組織抗原暴露有影響，但可以抗原修復(fù)，所

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