293-F懸浮細(xì)胞

細(xì)胞描述：   
293-F懸浮細(xì)胞源自于 293細(xì)胞株。用于高表達(dá)蛋白。
293-F懸浮細(xì)胞增殖能力取決于細(xì)胞取材、培養(yǎng)技術(shù)、培養(yǎng)條件等綜合因素。請按照正確的培養(yǎng)方法來解凍、傳代，以此保證細(xì)胞具備良好的增殖能力，方便您的后繼研究順利進(jìn)行。

質(zhì)量控制：   
本細(xì)胞經(jīng)過了檢測，不含有細(xì)菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）、支原體。 

培養(yǎng)條件：
37℃，8% CO2，PH值7.2~7.4，125rpm，無菌恒溫培養(yǎng)。
用途：
本產(chǎn)品只提供給進(jìn)一步的科研使用，不可應(yīng)用于治療等其他方面。

細(xì)胞相關(guān)操作：

293F細(xì)胞復(fù)蘇

1.37°C水浴預(yù)熱培養(yǎng)基（FreeStyle? 293 Expression Medium）；
2.從液氮中取出細(xì)胞迅速放入37°C水浴快速解凍（解凍后不要繼續(xù)暖細(xì)胞）；
3.在超凈臺中加入5ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，1000rpm離心5min；
4.棄上清，加入5ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用血小球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按細(xì)胞密度4-5×105/ml接種到25ml無菌搖瓶中（帶空氣過濾通氣孔的搖瓶）；
5.搖瓶置于37°C，8% CO2的培養(yǎng)箱中的搖瓶架上，125rpm培養(yǎng)。

293F細(xì)胞傳代
1.取細(xì)胞計數(shù)(詳見293F細(xì)胞凍存)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1.0-3.0×106/ml時（不要超過3.0×106cells/ml），可傳代；

2.37°C水浴預(yù)熱培養(yǎng)基（FreeStyle? 293 Expression Medium）；

3.在超凈臺中，加適量預(yù)熱好的培養(yǎng)基到無菌搖瓶中，以細(xì)胞終密度為6-7×105/ml接種細(xì)胞（也可1000rpm，5min離心后棄上清，用預(yù)熱好的培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為6-7×105/ml），轉(zhuǎn)移到無菌搖瓶中；

4. 搖瓶置于37°C，8% CO2的培養(yǎng)箱中的搖瓶架上，125rpm培養(yǎng)。

注：293F細(xì)胞對氧的要求較高，因此，懸浮培養(yǎng)必須具有高表面積體積比，否則細(xì)胞的生長會受到抑制。培養(yǎng)基的體積不能超過搖瓶的五分之二；即100毫升的搖瓶不能超過40ml培養(yǎng)基，250ml搖瓶不能超過100ml培養(yǎng)基。

293F細(xì)胞凍存

1.細(xì)胞計數(shù):

1)洗凈晾干血小板計數(shù)板和蓋玻片，將蓋玻片*覆蓋計數(shù)區(qū)；

2)充分混勻細(xì)胞，取少量(0.1-0.5ml)細(xì)胞懸液與等體積的染色液臺盼藍(lán)混合，移液器吹吸混合均勻，用移液器取20ul混合液從蓋玻片兩端(與中間凹槽平行的兩端)分別打入細(xì)胞，以細(xì)胞懸液剛好浸濕蓋玻片為佳；

3)顯微鏡下，數(shù)四個計數(shù)區(qū)的總細(xì)胞數(shù)，無活性細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞不被染色；

4)細(xì)胞密度=細(xì)胞總數(shù)/4×10000×2；
這里10000是不變的，因為計數(shù)的細(xì)胞是在體積為1mm×1mm×0.1mm即10-4cm3計數(shù)池內(nèi)，1cm3=1ml，將四個計數(shù)區(qū)的細(xì)胞數(shù)除以4取平均數(shù)，乘2是補(bǔ)償加等體積臺盼藍(lán)形成的稀釋。

5)細(xì)胞活性=活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×*。

注:細(xì)胞密度高時，可調(diào)整細(xì)胞懸液和臺盼藍(lán)的比例，計數(shù)時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可。

2.當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到傳代密度且細(xì)胞活性在90%以上時，可以凍存細(xì)胞。

3.37°C水浴預(yù)熱培養(yǎng)基（FreeStyle? 293 Expression Medium）。

4.在超凈臺中將要凍存的細(xì)胞移入離心管，1000rpm離心5min。

5.棄上清，用90%培養(yǎng)液+10%DMSO的混合液重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為5-10×106/ml。

6.將細(xì)胞懸液分裝到凍存管中(1-1.5ml/管)。

7.將裝有細(xì)胞的凍存管放入程序降溫凍存盒，-20°C放1-2h后，-80°C過YE，然后快速轉(zhuǎn)移到液氮中。

293F細(xì)胞貼壁培養(yǎng)

1. 37°C水浴預(yù)熱培養(yǎng)基（FreeStyle? 293 Expression Medium+10%FBS）；
2. 從液氮中取出細(xì)胞迅速放入37°C水浴快速解凍（解凍后不要繼續(xù)暖細(xì)胞）；
3. 在超凈臺中加入5ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，1000rpm離心5min；
4. 棄上清，加入5ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)入T25培養(yǎng)瓶中，輕輕晃勻；
5. 置于37°C，8% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

6. 4-6小時后，用新鮮的培養(yǎng)基給細(xì)胞換液后繼續(xù)培養(yǎng)；

7. 每天觀察細(xì)胞的狀態(tài)和長勢；

8. 當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時，給細(xì)胞傳代；

9. 在超凈臺中，棄培養(yǎng)基，加入2-5mlPBS清洗細(xì)胞后，再加入1ml胰酶消化細(xì)胞；

10. 顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓，有細(xì)胞開始脫離瓶壁時，加入5ml培養(yǎng)基（FreeStyle? 293 Expression Medium+10% FBS）終止消化；

11. 用移液器輕輕吹下瓶壁上剩余的細(xì)胞，并輕輕吹打?qū)⒓?xì)胞吹散；

12. 將細(xì)胞移入離心管中，1000rpm離心5min；
13. 棄上清，加入15-20ml的培養(yǎng)基（含血清）重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)入T75培養(yǎng)瓶中或按適當(dāng)比例傳到T25瓶中（確保細(xì)胞貼壁后融合度在25-50%之間），細(xì)胞密度在1×104 cells/cm2 (2.5×105 cells/T-25瓶），混勻細(xì)胞懸液，確保細(xì)胞均勻分布