BestBio貝博生物  細(xì)胞膜/胞漿/核膜蛋白分步提取試劑盒  BB-31042

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 使用方便，從細(xì)胞，組織中提取蛋白不需經(jīng)過(guò)研磨、反復(fù)凍融、超聲破碎等前處理。
2. 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。
3. 紫外檢測(cè)蛋白濃度時(shí)，背景干擾低。
4. 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含7種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

試劑盒以外自備試劑和儀器

● 移液器、吸頭       ● 離心機(jī)及離心管

● 渦旋振蕩器         ● 冰箱，冰盒

BestBio貝博生物  細(xì)胞膜/胞漿/核膜蛋白分步提取試劑盒  BB-31042

使用方法：

使用注意事項(xiàng)：

1. 旋帽離心管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。
2. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個(gè)過(guò)程須保持樣品處于低溫。
3. 蛋白酶抑制劑儲(chǔ)存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。
4. 可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。

蛋白提取步驟：

1. 提取液制備：每400ul冷的蛋白提取液A/D中加入分別加入2ul蛋白酶抑制劑混合物和2ul磷酸酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
2. 取5-10×10⁶個(gè)細(xì)胞^①，在4℃，1000rpm條件下離心5-10分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞。（組織樣本50-100mg剪碎，加冷PBS，用組織勻漿器勻漿至無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)固體（或用液氮研磨），冰上靜置5分鐘，小心將勻漿吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。在4℃，500g條件下離心2-3分鐘，棄上清。）
3. 用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。
4. 每5×10⁶個(gè)細(xì)胞中加入400ul冷的蛋白提取液A，混勻后，在4℃條件下用試劑盒所配針筒反復(fù)吸吹細(xì)胞，使細(xì)胞*破裂。
5. 在4℃，1000g條件下離心5分鐘。
6. 快速將上清（I）吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，在沉淀中加入200μl冷的提取液B，高速渦旋振蕩15秒。
7. 將混勻的提取液B置2-8℃振蕩1-2小時(shí)，至沉淀充分裂解，沉淀明顯減少。
8. 37℃水浴10分鐘，37℃下^②1000g-2000g力離心5分鐘，此時(shí)溶液分為兩層（對(duì)著光線(xiàn)看），上層為核內(nèi)蛋白，下層是核膜蛋白約為20-40μl。小心移除上層，用1-2倍體積的提取液D溶解下層即為細(xì)胞核膜蛋白。
9. 在步驟6中所得到的上清（I）中加入5ul提取液C，充分混勻。37℃水浴10分鐘。
10. 37℃下^② 1000g離心3分鐘，此時(shí)溶液分為兩層（對(duì)著光線(xiàn)看），上層是胞漿蛋白部分，下層是細(xì)胞膜蛋白部分約為40-50μl。
11. 將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到胞漿蛋白。
12. 用80-200μl冰冷的提取液D溶解步驟10中的下層部分，即得細(xì)胞膜蛋白。
13. 將上述蛋白提取物定量^③后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌?shí)驗(yàn)^④。

注：

① 細(xì)胞數(shù)量根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況調(diào)整，每次的裂解液用量并不是一定的，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。

② 必需保證在37℃左右下離心，至少確保30℃以上。無(wú)可控溫的離心機(jī)時(shí)，用常溫的離心機(jī)在室溫離心即可，適當(dāng)縮短離心時(shí)間至2-3分鐘。

③ 建議用BCA法進(jìn)行蛋白定量。

④ 蛋白樣品－80℃存放一年沒(méi)有問(wèn)題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細(xì)菌污染。

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