酸性蛋白酶（Acid Protease，ACP）試劑盒分光光度法

產(chǎn)品名稱:酸性蛋白酶（Acid Protease，ACP）試劑盒分光光度法

貨號(hào)：SH159K

規(guī)格：50 管/24 樣

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加10 mL蒸餾水溶解。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加入10 mL試劑一，沸水浴溶解。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入50 mL蒸餾水溶解。

試劑五：液體×1瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1支，0.25 μ mol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液，4℃保存。

產(chǎn)品說明：

ACP是一種在酸性環(huán)境下催化蛋白質(zhì)水解的酶。該酶主要用于酒精發(fā)酵、啤酒釀造、毛皮軟化、果酒澄清、醬油釀造、飼料等。

酸性條件下，ACP催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸；在堿性條件下，酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍(lán)；鎢藍(lán)在680nm有特征吸收峰，通過測定其吸光度增加，來計(jì)算ACP活性。

所需儀器及設(shè)備：

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿、1.5 mL EP管和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提?。?/span>

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液。

2. 血清或培養(yǎng)液：直接測定。

3. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

二、測定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到680 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二、試劑三和試劑四置于30℃水浴保溫30min。

3. 對照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL試劑二，混勻后置于30℃水浴保溫10min；加入200μL試劑三，混勻后8000g，4℃離心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm測定光吸收，記為A對照管。

4. 測定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL試劑三，混勻后置于30℃水浴保溫10min；加入200μL試劑二，混勻后8000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm測定光吸收，記為A測定管。（注意與空白管不同，先加試劑三，后加試劑二）

5. 空白管：取EP管，加入200μL蒸餾水，1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm測定光吸收，記為A空白管。

6. 標(biāo)準(zhǔn)管：取EP管，加入200μL標(biāo)準(zhǔn)品，1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm測定光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測定一次。

三、ACP活性計(jì)算公式：

1. 按照蛋白濃度計(jì)算

ACP活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。

ACP活性（nmol/min/mg prot）= C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V1）÷T= 625×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷Cpr

C標(biāo)準(zhǔn)品：0.25 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液；稀釋倍數(shù)：（100+200+200）÷200=2.5；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），注意該粗酶液不能直接用于蛋白質(zhì)含量測定，需要另外測定；建議稱取同樣質(zhì)量的樣品，加入1mL蒸餾水勻漿提取離心后，用本公司蛋白質(zhì)含量測定試劑盒測定；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL），100μL=0.1 mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），10min。

1. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

ACP活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1 nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。

ACP活性（nmol/min/g）=C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）× 稀釋倍數(shù)÷（W×V1÷V2）÷T=625×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷W

C標(biāo)準(zhǔn)品：0.25 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液；稀釋倍數(shù)：（100+200+200）÷200=2.5；W：樣品質(zhì)量（g）；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL），100μL=0.1 mL；V2：粗酶液總體積（mL），1mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），10min。

1. 按照液體體積計(jì)算

ACP活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1 nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。

ACP活性（nmol/min /mL）=C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）× 稀釋倍數(shù)÷V1÷T= 625×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）

C標(biāo)準(zhǔn)品：0.25 μ mol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液；稀釋倍數(shù)：（100+200+200）÷200=2.5；V1：加入反應(yīng)體系中血清或培養(yǎng)液體積，100μL=0.1 mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間，10min。

1. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

ACP活性單位定義：30℃每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化水解產(chǎn)生1 nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。

ACP活性（nmol/min/10⁴ cell）=C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（細(xì)胞數(shù)量×V1÷V2）÷T = 625×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷細(xì)胞數(shù)量

C標(biāo)準(zhǔn)品：0.25 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液；稀釋倍數(shù)：（100+200+200）÷200=2.5；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積，100μL=0.1 mL；V2：粗酶液總體積，1mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間，10min。

注意事項(xiàng)：

1. 臨用前配制的試劑配置好后3天內(nèi)使用完畢。