實(shí)驗(yàn)原理

透射電子顯微鏡(TEM)利用高能電子束穿透超薄樣品，通過電磁透鏡成像系統(tǒng)放大觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)
。其分辨率可達(dá)0.1-0.2nm，能清晰顯示細(xì)胞膜、細(xì)胞器、染色質(zhì)等亞顯微結(jié)構(gòu)
。

關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)步驟

樣品前處理

1. ?細(xì)胞固定?：

• 2.5%戊二醛(0.1M PBS配制)4℃初固定2-4小時(shí)
  

• 1%鋨酸后固定1-2小時(shí)(需避光操作)
  

2. ?脫水處理?

• 梯度乙醇(50%-100%)逐級(jí)脫水
  

• 環(huán)氧丙烷作為中間過渡溶劑
  

包埋與切片

1. ?包埋劑配制?：

• 環(huán)氧樹脂Epon812與硬化劑DDSA、MNA按比例混合
  

2. ?包埋程序?：

• 樹脂滲透：環(huán)氧丙烷與樹脂1:1混合浸透2小時(shí)
  

• 純樹脂包埋：60℃聚合48小時(shí)
  

3. ?超薄切片?：

• 切片厚度控制在60-80nm(灰色干涉色)
  

• 使用鉆石刀切取，銅網(wǎng)收集切片
  

染色處理

1. ?醋酸鈾染色?：

• 2%醋酸鈾乙醇溶液染30分鐘
  

2. ?檸檬酸鉛染色?：

• Reynold's檸檬酸鉛染5-10分鐘
  

• 注意避免二氧化碳污染
  

觀察要點(diǎn)

• ?細(xì)胞膜系統(tǒng)?：觀察質(zhì)膜完整性、線粒體脊結(jié)構(gòu)
  

• ?細(xì)胞核?：染色質(zhì)分布狀態(tài)、核膜連續(xù)性
  

• ?特殊結(jié)構(gòu)?：

• 干細(xì)胞偽足形態(tài)(胚胎樣干細(xì)胞可見花多樣偽足)
  

• 鐵死亡細(xì)胞特征(線粒體縮小、膜密度增加)
  

注意事項(xiàng)

1. ?樣品質(zhì)量?：

• 避免人工假象(如冰晶損傷、收縮裂隙)
  

• 凋亡細(xì)胞需與壞死細(xì)胞鑒別(染色質(zhì)邊集vs均勻腫脹)
  

2. ?操作規(guī)范?：

• 鋨酸廢液需專用容器收集
  

• 鉛染色需在NaOH干燥環(huán)境中進(jìn)行
  

3. ?設(shè)備參數(shù)?：

• 加速電壓通常設(shè)置80-120kV
  

• 使用CCD相機(jī)記錄圖像(避免長(zhǎng)時(shí)間電子束照射)

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