常用檢測(cè)方法

1. 熒光探針法

• ?原理?：使用鈣離子敏感熒光探針(如Fluo-3、Fluo-4)與Ca2?結(jié)合后產(chǎn)生熒光信號(hào)變化
  

• ?操作流程?：

1. 探針負(fù)載：將細(xì)胞與熒光探針共孵育(通常30-60分鐘)
   

2. 洗滌去除多余探針
   

3. 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度變化(激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)約488/525nm)
   

• ?優(yōu)勢(shì)?：靈敏度高、可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)
  

2. 流式細(xì)胞術(shù)

• ?應(yīng)用?：高通量分析群體細(xì)胞Ca2?濃度分布
  

• ?特點(diǎn)?：

• 結(jié)合熒光探針使用
  

• 可同時(shí)檢測(cè)其他參數(shù)(如細(xì)胞周期)
  

3. 共聚焦顯微鏡技術(shù)

• ?優(yōu)勢(shì)?：亞細(xì)胞分辨率，可定位Ca2?信號(hào)空間分布
  

• ?應(yīng)用?：研究局部鈣信號(hào)(如突觸小體鈣震蕩)
  

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要點(diǎn)

樣本制備

• ?細(xì)胞狀態(tài)?：建議使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(70-80%融合度)
  

• ?對(duì)照設(shè)置?：

• 陰性對(duì)照(無探針組)
  

• 陽(yáng)性對(duì)照(鈣離子載體處理組)
  

參數(shù)優(yōu)化

• ?探針濃度?：避免過度負(fù)載導(dǎo)致的細(xì)胞毒性
  

• ?檢測(cè)時(shí)間?：根據(jù)信號(hào)動(dòng)態(tài)范圍確定(通常5-30分鐘)
  

• ?溫度控制?：維持37℃恒溫環(huán)境
  

數(shù)據(jù)分析

信號(hào)處理

• ?基線校正?：扣除背景熒光
  

• ?標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)?：ΔF/F?=(F-F?)/F?
  

• ?動(dòng)力學(xué)參數(shù)?：

• 峰值幅度

• 上升/下降時(shí)間常數(shù)
  

注意事項(xiàng)

1. ?避光操作?：熒光探針易光漂白
   

2. ?鈣緩沖系統(tǒng)?：控制胞外Ca2?濃度
   

3. ?多參數(shù)驗(yàn)證?：建議結(jié)合電生理或分子生物學(xué)方法
   

4. ?設(shè)備校準(zhǔn)?：定期進(jìn)行熒光強(qiáng)度標(biāo)定