HRP標(biāo)記試劑盒使用方法：

1.準(zhǔn)備標(biāo)記物：首先去除待標(biāo)記物（蛋白或者抗體）中的疊氮鈉、甘油、氨基物質(zhì)（包括甘氨的酸、Tris等）、EDTA等物質(zhì)?？刹捎猛肝龌虺瑸V的方法置換緩沖液，以除去以上物質(zhì)，以達(dá)到優(yōu)良標(biāo)記效果。透析緩沖液0.01M CB,PH:9.6 緩沖液(說明書附件有經(jīng)驗(yàn)配方無需調(diào)整PH），若實(shí)驗(yàn)室沒有碳酸鹽試劑再采用0.01M PBS（PH:7.0-7.4均可）透析或超濾置換緩沖液，最后將抗體/蛋白調(diào)整到濃度2mg/ml；如果抗體和蛋白不含上述這些干擾物質(zhì)可以直接用上述PBS或CB緩沖液調(diào)整濃度到2mg/ml備用。對于小分子物質(zhì)不建議直接標(biāo)記HRP，若仍需標(biāo)記，需要自行摸索濃度，保證HRP的比例過量，如果不能確保HRP過量，標(biāo)記完之后最好透析或過濾除去未標(biāo)記的小分子物質(zhì)。

2.以下以標(biāo)記1mg抗體（2mg/ml）為例詳細(xì)說明實(shí)驗(yàn)流程：

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

   從4℃中取出HRP標(biāo)記試劑盒，各組分使用前混勻。

標(biāo)記反應(yīng)

待標(biāo)記抗體 500µl（1mg，2mg/ml），加入預(yù)活化HRP（100ul，1mg，抗體:HRP標(biāo)記質(zhì)量比按照 1：1) 用移液器反復(fù)吹打幾次以充分混勻，混勻后加入HRP標(biāo)記啟動液108ul，（加入啟動液量比例：每10ul（抗體和HRP混合液）加1.8ul啟動液）繼續(xù)混勻數(shù)次，避免產(chǎn)生氣泡。然后避光30℃-37℃溫箱偶聯(lián)反應(yīng)2-3小時(shí)，若遇快要下班也可放4℃反應(yīng)24小時(shí)左右（此法效果一樣或者更好不必?fù)?dān)心）。

標(biāo)記反應(yīng)終止

單支標(biāo)記終止液（凍干粉）中加入1ml去離子水配成標(biāo)記終止液，取50ul加入步驟2所述反應(yīng)液中（加入標(biāo)記終止液量比例：每1mg HRP加入終止液50ul），充分混勻，室溫放置1小時(shí)或者4℃ 2小時(shí)。（注：標(biāo)記終止液不穩(wěn)定，不能保存，必須現(xiàn)配現(xiàn)用）

標(biāo)記物產(chǎn)物收集與保存

終止完成后，加入等體積的標(biāo)記物保存液，充分混勻，置于-20℃可以保存一年。如果想更長期的保存建議先用0.067M PBS  PH:7.0（說明書附件有經(jīng)驗(yàn)配方）透析或超濾置換緩沖液后再加標(biāo)記物保存液。這樣可以保存3年左右甚至更長。

反應(yīng)體系摘要：

溶液名稱：待標(biāo)記抗體+活化HRP+標(biāo)記啟動液+標(biāo)記終止液+保存液

溶液體積：  500µl   +  100µl  +    108µl   +  50µl    + 758µl =1516µl

注意事項(xiàng)：

待標(biāo)記物緩沖液成分過于復(fù)雜以及含有氨基小分子和NAN3的初始緩沖液必須透析或超濾置換掉，請采用0.01M PBS（PH:7.0-7.4均可）或0.01M CB，PH:9.6緩沖液均可。

如果待標(biāo)記物不是抗體是其它蛋白，那么請根據(jù)分子量參考蛋白和酶用量：若分子量在40KD以上建議1mg蛋白使用1mg HRP；如果分子量在30KD左右，建議1mg蛋白使用1.3mg HRP；如果分子量在20KD左右，建議1mg蛋白使用2mg HRP；如果分子量在10KD左右，建議1mg蛋白使用4mg HRP；此時(shí)啟動液和終止液請按步驟2和3描述標(biāo)準(zhǔn)適量加入；如果標(biāo)記量為小于1mg的抗體或蛋白（最小可以0.1mg），HRP和其它試劑加入量按比例折算即可。

小分子藥物不建議直接標(biāo)記HRP，因?yàn)镠RP的結(jié)構(gòu)不能結(jié)合足夠的藥物會造成效價(jià)偏低，這種情況建議先偶聯(lián)BSA增加小分子偶聯(lián)量再進(jìn)行HRP標(biāo)記，這樣效果會非常好。

如果待標(biāo)記物含有其它蛋白需要把無關(guān)蛋白同樣計(jì)算進(jìn)去，盡快如此也請您慎重選擇這樣的樣品進(jìn)行標(biāo)記。

本試劑盒保存4℃可以保證1年內(nèi)開啟有效，活化HRP開啟后小心取用切勿污染堿性物質(zhì)。

終止液干粉5000ug規(guī)格5支/1000ug規(guī)格2支，原則上每一支配好后僅限一次性使用，因此您可以根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)總量合理配制使用。