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連接scFv和載體DNA并轉(zhuǎn)化大腸桿菌

2013-3-2  閱讀(1325)

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[器材和試劑]
● 去離子水(millipore)
● T4DNA連接酶和10×連接酶緩沖液(NEB)
● 16℃水浴
● 消化的scFv文庫(kù)DNA
● pHENl DNA,用NcoI和NotI消化(100ng/ul)
● 電感受態(tài)大腸桿菌TGl細(xì)胞(Strat aeene)
● 用于將scFv文庫(kù)電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TGl株的試劑和設(shè)備

[方法]
1.配制1個(gè)50ul連接混合液,包含:
● 10×連接緩沖液,5uI
● 水,16ul
● NcoI和NotI消化的pHENl(100g/ul), 20ul
● VcoI和NotI消化的scFv文庫(kù)(100g/ul), 7ul
● T4 DNA連接酶(400U/ul),2ul
2.16℃孵育反應(yīng)液過(guò)夜。
3.乙醇沉淀DNA并用70%乙醇洗滌沉淀1次。
4.重懸DNA于10ul水中。
5.用4份相同的2.5ul的DNA分別電轉(zhuǎn)化到電感受態(tài)大腸桿菌TGl細(xì)胞中。
6.確定文庫(kù)容量,并將菌文庫(kù)材抖儲(chǔ)存于-70℃。

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