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再擴增SCFvVLCDR3基因文庫

2013-3-2  閱讀(1281)

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[器材和試劑]
● PCR試劑和設(shè)備
● Winard PCR純化試劑盒(Promega)
● 定制的DNA引物
● VL—NotI引物 (5,—GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC TAG CAC GGT CAG CTT GGT CCC TCC GCC GAA CAC CCA ACC—3’)
● LMB3引物
● 用于scFv基因文庫限制性消化的試劑和設(shè)備
● 已擴增的scFv基因文庫DNA

[方法]
1.配制4個50ul PCR反應(yīng)混合液, 包含:
● 去離子水,35.5ul
● 20×dNTP(每種5mmol/L),2.5ul
● 10×Vent聚合酶緩沖液,5.0ul
● LMB3引物 (10pmol/ul), 2.5ul
● VL—NotI引物 (10pmol/ul), 2.5ul
● scFV基因模板DNA(100ng), 1ul
● VentDNA聚合酶(2單位),1.0ul
2.在有加熱蓋的熱循環(huán)儀內(nèi),加熱反應(yīng)混合液到94℃5分鐘。
3.以94℃1分鐘、42℃1分鐘、72℃2分鐘的條件共循環(huán)30次,擴增VL基因。
4.用Winard PCR純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。
5.用NcoI和NotI消化PCR產(chǎn)物。

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