如何動態(tài)檢測活細(xì)胞內(nèi)的Caspase-1的活性，做更真實(shí)的實(shí)驗(yàn)？艾美捷推薦Immunochemistry Tech（ICT）的FLICA系列科研工具，輕松檢測活細(xì)胞Caspase-1 活性。  

艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析試劑盒原理：

FLICA試劑FAM-YVAD-FMK（Ex/Em = 488nm/530nm），是無細(xì)胞毒性的，細(xì)胞膜滲透抑制劑。進(jìn)入每個細(xì)胞，并不可逆地與活化的caspase-1結(jié)合。任何未結(jié)合的FAM-YVAD-FMK-FLICA試劑擴(kuò)散出細(xì)胞并被沖走。因此留在細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光直接體現(xiàn)了活性caspase-1酶活性的。熒光結(jié)果可通過熒光酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析試劑盒組分：

推薦的材料：

•DMSO，每小瓶50µL，用于重建FLICA

•DiH20，135-540 mL，稀釋10X凋亡洗滌緩沖液

•磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）pH 7.4，最高100mL，稀釋FLICA并處理細(xì)胞

•處理細(xì)胞時，將FBS和/或BSA添加到緩沖液中

•在實(shí)驗(yàn)條件下處理的培養(yǎng)細(xì)胞或組織可隨時標(biāo)記

•誘導(dǎo)胱天蛋白酶活性并產(chǎn)生對照品如星孢菌素（#6212），喜樹堿（#6210）或尼格瑞林（#6698)

•90%乙醇或3%甲醛，產(chǎn)生活/死碘化丙啶染色對照

•黑色96孔微量滴定板，平底，未處理，非無菌（ICT目錄#266）。如果使用底部讀數(shù)儀器，使用黑色板墻壁和透明的底部。如果在使用無菌黑色組織培養(yǎng)板。

•血細(xì)胞儀

•200 x g離心

•15 mL聚丙烯離心管（每個樣品）

Caspase-1活性分析試劑盒檢測設(shè)備：

可通過以下方法分析分析：

•熒光顯微鏡

•熒光板讀取器

•流式細(xì)胞儀

使用接近這些設(shè)置的過濾器對：

•FAM-FLICA最佳激發(fā)波長為488-492 nm，峰值發(fā)射波長為515-535納米。

•在長通濾波器下觀察碘化丙啶（PI）488-492nm，發(fā)射>610nm；核結(jié)合PI在617nm處具有最大發(fā)射。

•使用365 nm激發(fā)的紫外濾光片可以看到Hoechst 33342以及480nm的發(fā)射。

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：

用FLICA染色細(xì)胞可以在幾個小時內(nèi)完成。然而FLICA用于活細(xì)胞，需要定期維護(hù)和提前幾天栽培。此外，一旦正確的數(shù)字已經(jīng)培養(yǎng)了個細(xì)胞，必須為實(shí)驗(yàn)分配時間治療或半胱天冬酶激活過程。創(chuàng)建細(xì)胞群，例如：

a、 暴露于實(shí)驗(yàn)處理的細(xì)胞

b、 接受安慰劑的陰性對照細(xì)胞群

當(dāng)FLICA檢測到催化活性形式的胱天蛋白酶時酶，計劃實(shí)驗(yàn)，以使FLICA在細(xì)胞中預(yù)期胱天蛋白酶被激活時被稀釋和給藥。30X FLICA的推薦體積為每300µL細(xì)胞10µL3-5 x 105細(xì)胞/mL，但數(shù)量可能因?qū)嶒?yàn)而異條件和用于分析的儀器。每位研究者應(yīng)調(diào)整FLICA的量以適應(yīng)特定細(xì)胞系研究條件。將細(xì)胞培養(yǎng)至適合特定實(shí)驗(yàn)條件的最佳密度或凋亡誘導(dǎo)方案。細(xì)胞密度不應(yīng)超過106細(xì)胞/超過此濃度培養(yǎng)的細(xì)胞可開始自然生長進(jìn)入凋亡?？赡苄枰M(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)來確定何時以及使用多少FLICA作為產(chǎn)生的正信號是培養(yǎng)過程中caspase活性的直接測量。