細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的基本特征之一,它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面起著十分重要的作用。在細(xì)胞凋亡過程中,細(xì)胞內(nèi)膜的磷酯酰絲氨酸外翻到細(xì)胞外膜,而Annexin V(膜聯(lián)蛋白V)對其有天然的高親和能力,故可以用FITC標(biāo)記(綠色熒光)的Annexin V來檢測細(xì)胞凋亡,但本方法的缺點是不能區(qū)分早期和晚期的凋亡細(xì)胞。早期和晚期的凋亡細(xì)胞的一個重要區(qū)別在于細(xì)胞膜的完整性(凋亡早期細(xì)胞沒有喪失膜的完整性),故可以用碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)來染色加以區(qū)分。

艾美捷Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒特點：

1. 即開即用,不需要專門花時間準(zhǔn)備各種成分。

2. 整合了Annexin V-FITC和PI檢測法的優(yōu)點,提高了凋亡細(xì)胞檢測的靈敏度和特異性,本方法是目前極為靈敏的細(xì)胞凋亡檢測方法。

3. 跟流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測兼容。

艾美捷Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作步驟：

(一)獲得目的基因

1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設(shè)計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

(二)構(gòu)建重組表達(dá)載體

1、Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒載體酶切:將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點)進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

(三)  獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種

1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。

2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆,重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。

(四)誘導(dǎo)表達(dá)

1、 Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養(yǎng)。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。

3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。

4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。

5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

來源：艾美捷科技