N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物RNA分子中極為常見(jiàn)和豐富的修飾。由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物METTL3催化m6A修飾，并通過(guò)M6A RNA去甲基化酶FTO和ALKBH5，以α-酮戊二酸(α-KG)-和Fe2+-依賴(lài)的方式催化M6A去甲基化。METTL3、FTO和ALKBH5在許多生物中起著重要作用，從發(fā)育和代謝到生育的過(guò)程。在所有RNA堿基甲基化中，m6A占80%以上，存在于各種物種中。m6A主要分布在mRNA中同樣也發(fā)生在非編碼RNA中，如tRNA、rRNA和snRNA。在mRNA轉(zhuǎn)錄物中m6A的相對(duì)豐度已被證明影響RNA代謝過(guò)程，如剪接，核輸出，翻譯能力和穩(wěn)定性，以及RNA轉(zhuǎn)錄。由m6A RNA甲基酶和脫甲基酶缺陷引起的m6A甲基化水平異?？赡軐?dǎo)致RNA功能障礙并引起疾病。

例如，由于FTO突變患者的FTO活性增加，靶m RNA中m6A的異常低水平，通過(guò)一種未定義的途徑，導(dǎo)致肥胖和相關(guān)疾病的發(fā)生。對(duì)RNA的化學(xué)M6A修飾的動(dòng)態(tài)性和可逆性，也可作為一種具有深遠(yuǎn)生物學(xué)意義的新表觀(guān)遺傳標(biāo)記。因此，更多有用的信息，以更好地理解m6A RNA甲基氧化RNA 轉(zhuǎn)錄物的水平和分布有利于疾病的診斷和治療。

目前，有幾種方法被用于表位范圍的m6A映射。這些方法包括MeRIP，PA-m6A-seq，miCLIP和m6A-CLIP。MeRIP已被廣泛應(yīng)用，但在m6A分析中無(wú)法實(shí)現(xiàn)高分辨率。PA-m6A-seq、mi CLIP和m6A-CLIP提高了分析分辨率，但由于重復(fù)性差和工藝復(fù)雜。特別是，這些方法耗時(shí)（>2天）和費(fèi)用昂貴。為了解決這些問(wèn)題，m6A RNA甲基化片段富集試劑盒來(lái)了~

艾美捷m6A-RNA甲基化片段富集試劑盒【簡(jiǎn)稱(chēng)：MeRIP試劑盒】有以下特點(diǎn)：

1、高度富集：使用RNA 切割酶混合物同時(shí)對(duì)含有m6A 的目標(biāo)序列兩端的RNA 進(jìn)行片段化和切割/移除任何RNA 序列，而不影響被抗體占據(jù)的RNA 區(qū)域。短片段RNA 僅與抗m6A 抗體結(jié)合。因此，非常可靠地確定真正的m6A 富集目標(biāo)區(qū)域，并可實(shí)現(xiàn)高分辨率繪圖。

2、低輸入：不結(jié)合的RNA 切割和免疫捕獲是在同一個(gè)單管中處理的，這樣可最大限度地保護(hù)含有m6A的目標(biāo)區(qū)域，并最小化樣本損失，允許輸入RNA 低至500ng。

3、極小背景：在含m6A 目標(biāo)序列的兩(2)端切割非結(jié)合RNA 序列，可最小化MeRIP/測(cè)序背景，允許1000萬(wàn)讀的數(shù)據(jù)分析。

4、超快速、精簡(jiǎn)程序： 從RNA 到cDNA 文庫(kù)的過(guò)程小于3 小時(shí)，動(dòng)手時(shí)間<30 分鐘。

5、超級(jí)方便： 本試劑盒包含了每一步所需的所有組件，這足以捕獲含m6A 的RNA 序列，從而允許以一種很方便的方法來(lái)富集，結(jié)果可靠一致。

m6A-RNA甲基化片段富集試劑盒檢測(cè)原則和程序：

EpiQuik™ CUT&RUN m6A RNA富集（MeRIP）試劑盒包含所需的所有必要試劑用于從總RNA開(kāi)始成功地進(jìn)行m6A RNA富集。在反應(yīng)中，RNA切割/去除包含靶m6A的區(qū)域兩端的序列

使用珠結(jié)合的m6A捕獲抗體將含有m6A的片段下拉。富集的然后釋放、純化和洗脫RNA。試劑盒中包括非免疫IgG對(duì)照和m6A陽(yáng)性對(duì)照。這些可用于證明試劑盒的功效和富集RNA定量或生物分析儀步驟。

圖1：使用EpiQuik富集m6A RNA™ 切割并運(yùn)行m6A RNA富集（MeRIP）試劑盒：捕獲含有m6A的RNA片段通過(guò)抗m6A抗體（#A-1801，EpigenTek）從10µg人RNA和500ng陽(yáng)性對(duì)照寡核苷酸。非免疫IgG用作陰性對(duì)照。富集的RNA是純化并熒光定量用于富集倍數(shù)比較。

圖2：文庫(kù)片段的大小分布：m6A片段富集通過(guò)抗m6A抗體（#A-1801，EpigenTek）并用于cDNA文庫(kù)制備。峰值195 bps反映m6A抗體結(jié)合的RNA插入大?。s55個(gè)基點(diǎn)）