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Cas9核酸酶H840A的介紹與特異性

時間:2020/10/15閱讀:2062
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來自S. pyogenes的Cas9核酸酶是依賴于RNA介導的內切核酸酶,可以特異地切割雙鏈DNA(在DNA PAM存在的情況下,也可以切割單鏈DNA或單鏈RNA)。Cas9切割位點位于目標序列(target sequence)內,離PAM(NGG)區(qū)3個堿基。PAM對于Cas9的識別和切割都是必需的。因為反應需要添加RNA(sgRNA或者crRNA:tracrRNA),整個體系,包括Cas9酶都必需不含任何核酸酶活性。其中,Cas9中的HNH和RuvC結構域分別負責切割靶標DNA中與sgRNA配對和非配對的鏈。本產品中,Cas9的H840被突變?yōu)锳,使Cas9的HNH結構域失活。因此,Cas9(H840A)只有RuvC結構域有切割活性,是能夠形成單鏈缺刻的Nickase。

推薦反應體系(20 μL):

組分                                           體積
10×TOLO Buffer 3                     2 μL
250 nM sgRNA                          2 μL
1 μM Cas9(H840A)                    1 μL
30 nM substrate DNA                2 μL
Nuclease-free water upto          20 μL
Incubate at 37 °C for 1 h, 85 °C 10 min

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