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三聚氰胺（Melamine）快速檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
一、原理
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物三聚氰胺將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗三聚氰胺抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物三聚氰胺的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物三聚氰胺的含量。
二、試劑盒特性
試劑盒靈敏度： 15ppb
樣本檢測(cè)下限
牛 奶 ———————————— 75ppb
組織（雞/豬/鴨/魚(yú)/蝦/肝臟）———— 50ppb
飼 料 — —— — —— ————— 1500ppb
蛋 類(lèi) — —— — —— ————— 300ppb
交叉反應(yīng)率
三聚氰胺 — — —— —— — — — — —— — 100%
三聚氰酸 ——————— —— — — —— — 60%
三 嗪 —— — — — — — — — — — — — — < 1%
三嗪二銨 — — —— — — — — — — — —— < 1%
回收率
牛 奶 ………………………………90±15%
組 織 ………………………………85±10%
飼 料 ………………………………85±10%
蛋 類(lèi) ………………………………80±10%
三、試劑盒組成
1、 微量測(cè)試孔：每條8孔，一板12條
2、 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、15 ppb、
45 ppb、135ppb、405 ppb、1215 ppb
3、酶標(biāo)記物 12ml ……………… 紅色帽
4、抗體工作液 7ml ……………… 藍(lán)色帽
5、底物A液 7ml …………… … 白色帽
6、底物B液 7ml …………… … 白色帽
7、終止液 7ml …………… … 黃色帽
8、20X濃縮洗滌液 40ml ……………… 白明帽
9、5X濃縮復(fù)溶液 50ml………………透明帽
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：微孔板、酶標(biāo)儀、勻質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）
微量移液器：?jiǎn)蔚?20ul～200ul、100ul～1000ul
多道 250 ul
試劑： 乙腈 、氫氧化鈉 、濃鹽酸、去離子水、
正己烷
五、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
處理任何樣本時(shí)，都必須注意：
（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。
（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
樣本前處理需配制：
配液1：用去離子水將5×濃縮復(fù)溶液按1：4稀釋（1份濃縮復(fù)溶液+4份去離子水）。
配液2：1M HCl 取8.6ml濃HCl加水定溶至100ml。
配液3、1M NaOH 稱取4g NaOH加水定溶至100ml。
配液4、0.1M NaOH 稱取0.4g NaOH加水定溶100ml。
配液5、乙腈-0.1M NaOH溶液：84ml乙腈和16ml
0.1M NaOH混合均勻
（a）飼料樣品處理方法：
1、 將飼料樣品研碎，稱2.0±0.05g研碎的飼料樣品，加入2ml 1M HCl，加入16ml去離子水均質(zhì)。
2、 旋流3min，放振蕩器上振蕩5min
3、 15℃4000r/min以上離心15min，取出10ml上清液并用1M NaOH將pH值調(diào)至6-8。（注：因飼料樣品的不同，加入1M NaOH的量有所差異，根據(jù)情況調(diào)節(jié)，一般加入范圍是0.5ml—1ml之間）。
4、 15℃，4000r/min以上離心15min，吸出上清液。（如果上清仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過(guò)濾）。
5、 用稀釋后的復(fù)溶液10倍稀釋上清液（取100µl上清液加入900µl稀釋后的復(fù)溶液，并且混合均勻，混合30s）。
6、 取50µl進(jìn)行分析
樣本稀釋倍數(shù):100倍
（b）牛奶樣本處理方法：
1、 取2ml去除脂肪奶樣至離心管中；
2、 加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩5min，15℃ 4000r/min以上離心10min，取2ml上清液在60℃氮?dú)饬飨?干燥；
3、 用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；
4、 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：5倍
（c）組織（雞/豬/鴨/魚(yú)/蝦/肝臟）樣本處理方法：
1、取2.0±0.05g均勻組織樣本于50ml離心管中；
2、加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩5min，15℃ 4000r/min以上離心10min，取2ml上清液在60℃氮?dú)饬飨?干燥；
3、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；
4、取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：2 倍 檢測(cè)下限定為：50ppb
（d）蛋類(lèi)樣本處理方法：
1、用均質(zhì)器低速均勻樣本（蛋清、蛋黃或全蛋）
2、稱取2.0±0.05g均質(zhì)過(guò)的樣本，加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩5min；（注：蛋清含蛋白成份高，加入提取液后會(huì)形成一團(tuán)膠狀物，較蛋黃或全蛋難易搖勻，此情況為正常現(xiàn)象不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果）
3、15℃， 4000r/min以上離心10min，取1ml上清液在60℃氮?dú)饬飨?干燥；
4、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；
5、取下層相用稀釋好的復(fù)溶液按1：3 （50µl樣本液加150µl稀釋后的復(fù)溶液）稀釋，混合30s；
5、 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：20倍
六、 酶標(biāo)免疫分析程序:
測(cè)定前應(yīng)須知：
1、 使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。
4、 在所有恒溫孵育過(guò)程中，避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。
操作步驟：
1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水稀釋至800ml備用（或按需要量稀釋）。
4、 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。37℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
6、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl/孔，洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、 每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置37℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗板4-5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
8、 顯色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，輕輕振蕩混勻，37℃環(huán)境中避光顯色15min。
9、 測(cè)定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定每孔OD值。
七.結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含三聚氰胺量成負(fù)相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍（ng/ml）。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243；15ppb為1.816；45ppb為1.415；135ppb為0.74；405ppb為0.313；1215ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是135ppb-405ppb; 樣本2的濃度范圍是45ppb-135ppb，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中三聚氰胺實(shí)際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即
| 百分吸光度值（%）＝ | B | ×100% |
| B0 |
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/L）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中三聚氰胺實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大
量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索取）
八、注意事項(xiàng)
1、 室溫低于20℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、 試劑混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。
6、 將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 試劑變質(zhì)的跡象
顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5（A450nm<0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8、 加底物溶液一般顯色15min即可，若顏色較淺，可適當(dāng)延長(zhǎng)顯色時(shí)間，但不能超過(guò)30min。
9、 該試劑盒*反應(yīng)溫度為37℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期
儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒
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