轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）是指在某一特定的生理條件下，細胞、組織或生物體內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，即轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA總和，包括編碼RNA（即mRNA）和非編碼RNA（如tRNA、rRNA、miRNA、lncRNA、circRNA）等多種不同類型的RNA分子。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）是一門從整體水平上研究轉(zhuǎn)錄組基因表達和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的學(xué)科，包括研究基因表達水平變化、轉(zhuǎn)錄本的種類、定位、注釋、可變剪接以及每個基因轉(zhuǎn)錄本在基因組中的結(jié)構(gòu)和功能研究等。

相對于傳統(tǒng)的表達譜基因芯片技術(shù)，高通量RNA測序無須預(yù)先針對已知序列設(shè)計探針，即可對研究物種的整體轉(zhuǎn)錄組進行檢測，在分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達水平的同時，還能發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本，精確地識別可變剪切位點，檢測融合基因, 發(fā)現(xiàn)新的長非編碼RNA（lncRNA）以及環(huán)狀RNA（circRNA），提供更為全面的轉(zhuǎn)錄組信息。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序分類

目前常見的高通量測序在轉(zhuǎn)錄組學(xué)中的應(yīng)用包括mRNA-seq、lncRNA-seq、small RNA-seq/ miRNA-seq、circRNA-seq等。

1.mRNA-seq

mRNA-seq可進行差異表達分析、推測mRNA結(jié)構(gòu)、識別可變剪切位點以及cSNP（編碼序列單核苷酸多態(tài)性）、解析RNA編輯等。mRNA-seq的過程基本包括樣本RNA提取、建庫前的樣本質(zhì)檢、文庫構(gòu)建、文庫質(zhì)控、上機測序、數(shù)據(jù)分析等。

圖1：mRNA-seq建庫流程圖

測序完成后，需要經(jīng)過生物信息學(xué)分析將高通量測序數(shù)據(jù)包含的信息解讀出來，包括測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)比對、轉(zhuǎn)錄本拼接及后續(xù)的個性化分析。

2. lncRNA-seq

lncRNA（長鏈非編碼RNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt、不編碼蛋白質(zhì)的RNA。lncRNA在表觀遺傳學(xué)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控發(fā)揮著重要作用。高通量測序技術(shù)被廣泛用于lncRNA的鑒定、表達分析和功能預(yù)測。

大部分長鏈非編碼RNA與編碼RNA相似，具有5‘端帽子結(jié)構(gòu)和3’端poly（A）尾巴，但同時也存在一定數(shù)目的長鏈非編碼RNA并不帶有poly（A）尾巴。所以構(gòu)建lncRNA的測序文庫時，提取出的總RNA需用rRNA去除的方式來富集lncRNA。

圖2：rRNA去除原理（圖片來自international.neb.）

3. small RNA-seq/ miRNA-seq

小RNA（small RNA）主要包括miRNA、siRNA和piRNA，參與誘導(dǎo)基因沉默、細胞生長、發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等諸多生命活動的調(diào)控過程。通過高通量測序，可以發(fā)掘、鑒定和定量出任何物種全基因組水平的小RNA圖譜、挖掘新的miRNA分子、預(yù)測靶基因、鑒定樣品間差異表達分析。

小RNA測序建庫前也需要對RNA樣本進行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格后可以選擇不同的方法建庫，常見的小RNA建庫流程是：3‘端加SR Adapter→反轉(zhuǎn)錄引物雜交→ 5’端加接頭→ 反轉(zhuǎn)錄→ PCR擴增→ PCR產(chǎn)物純化→ 文庫片段大小選擇→ 檢驗文庫的質(zhì)量。與長鏈RNA的建庫流程不同，小RNA建庫無需片段化，先加通用接頭再合成cDNA，index通過PCR擴增完成。小RNA文庫的片段選擇建議使用聚丙烯酰胺凝膠或者Pippin Prep進行片段篩選。文庫構(gòu)建完成質(zhì)檢合格便可安排上機測序，傳統(tǒng)一般是用雙端PE50的策略。

圖3：small RNA-seq建庫流程圖（圖片來自questgenomics.）

4. circRNA-seq

環(huán)狀RNA（circRNA）分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達更穩(wěn)定，不易降解。近幾年的研究表明，circRNA在生物的生長發(fā)育、對外界環(huán)境的抵御等方面具有重要的調(diào)控作用。circRNA可競爭性結(jié)合miRNA，發(fā)揮ceRNA的調(diào)控功能，調(diào)控基因表達。近年來還發(fā)現(xiàn)與疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，在疾病診斷標記物等方向具有很大的應(yīng)用前景。

circRNA的建庫方法采用去除rRNA，去除線性RNA的策略富集circRNA，并用鏈特異性建庫以區(qū)分circRNA來源與基因的正負鏈。

圖4：circRNA-seq建庫流程圖

結(jié)語

高通量測序技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)，給轉(zhuǎn)錄組學(xué)帶來了更全面、更準確、更低成本的數(shù)據(jù)，使得轉(zhuǎn)錄組學(xué)在臨床應(yīng)用如疾病相關(guān)基因功能的研究或分子標志物的發(fā)現(xiàn)等方面能夠更進一步。轉(zhuǎn)錄組測序?qū)τ诩膊“l(fā)病機制研究，以及疾病的診斷、預(yù)后等發(fā)揮了重要作用。利用高通量測序技術(shù)，人們已成功實踐基因表達模式分析和融合基因的檢測，相信未來轉(zhuǎn)錄組測序會給人類帶來更多益處。

轉(zhuǎn)錄組測序建庫優(yōu)選產(chǎn)品

Yeasen長期以來一直對高通量測序技術(shù)保持高度關(guān)注，公司現(xiàn)可提供illumina & MGI平臺高通量測序上游樣本文庫制備的完整產(chǎn)品線（包括對應(yīng)的建庫模塊和原料酶）。同時可根據(jù)客戶需求定制化開放測序產(chǎn)品，致力于獲取更準確、更全面的測序信息。

產(chǎn)品名稱：Hieff NGS® MaxUp II Dual-mode mRNA Library Prep Kit

產(chǎn)品特點：

1）精簡步驟，節(jié)約建庫時間

2）溫和可控的mRNA段化條件

3）耐高溫的第四代逆轉(zhuǎn)錄酶

4）優(yōu)異的文庫質(zhì)量和測序質(zhì)量

性能展示：鏈特異性文庫測序有超過98.5%的Reads比對到正義鏈。同時鏈特異性文庫的 Ambiguity reads更少，基因表達定量更準確。

產(chǎn)品列表：

HB200312