遺傳中心法則表明，DNA是生物體內遺傳信息的載體。遺傳信息在精密的調控下從DNA轉錄成RNA，再傳遞到蛋白質。因此RNA被認為是DNA與蛋白質之間生物信息傳遞的“橋梁”，在研究轉錄組信息中占有著重大的作用。

背景介紹

       轉錄組（transcriptome）是指在某一特定的生理條件下，細胞、組織或者生物體內所有的轉錄產物的集合，即轉錄出來的所有RNA總和，包括編碼RNA（即mRNA）和ncRNA（tRNA、rRNA、miRNA、lncRNA、circRNA）等不同類型的RNA分子。在這之中核糖體RNA (rRNA) 約占RNA總量的 80%，是多的一類RNA，通常這類RNA分子量比較大且代謝不活躍，種類包括：原核生物中5S rRNAs、16S rRNAs和23S rRNAs三種，真核生物中5S rRNAs、5.8S rRNAs、18S rRNAs和28S rRNAs四種。

圖1：RNA分類圖

rRNA的“作用”
      隨著人類基因組計劃（HGP）和DNA元件百科全書計劃（ENCODE）的完成，人們發(fā)現(xiàn)在人類基因組中大部分DNA都可以轉錄成RNA，但是僅有1.5%的核苷酸序列用于蛋白質的編碼，剩余不編碼蛋白質的的非編碼RNA（ncRNA），被認為是基因組轉錄噪音。這種轉錄組噪音（無效信息）基本全部來源于豐度zui高的成員——rRNA。
      測序的目的就是為了更多的獲得生物信息，但是rRNA這個在RNA中zui豐富的成員卻只能提供非常少的轉錄本的信息，且檢測到過多的rRNA會掩蓋其它基因的表達豐富度；因此，通常在測序之前從RNA樣品中除去rRNA，rRNA去除的效率也被視為zui大化讀取到轉錄物的關鍵因素。

圖2：人類組織或細胞總RNA中各種RNA分布餅狀圖

rRNA的“去除法”
       目前rRNA去除的方法主要有兩種，一種是通過DNA探針或者RNA探針雜交捕獲rRNA再用磁珠吸附去除的方法，這種方法稱為Ribo-Zero-seq；另一種是利用雙鏈特異性核酸酶處理的方法提取mRNA，稱為DSN-seq。兩種方法對應的原理與區(qū)分如下所示：

方法一（DSN-seq）
去除流程：特異性探針（區(qū)分物種）與rRNAs雜交——RNase H消化rRNAs——DNase I消化探針——其他RNA富集純化
占比：在市場現(xiàn)有品牌中占據絕大多數(shù)
優(yōu)勢：樣本起始量要求低；rRNA殘留量更低
缺點：其操作較復雜；暫無混合樣本效果驗證；

流程圖：

方法二（Ribo-Zero-seq）
去除流程：生物素標記探針與rRNAs雜交——鏈霉親和素磁珠去除探針與rRNAs——其他RNA富集純化
占比：Illumina RiboZero與Thermo RiboMinus系列使用該方法
優(yōu)勢：磁珠法，操作簡單；可應用于混合樣本；
缺點：樣本起始量要求高（一般為1 μg）；rRNA殘留量相對方法1略高；

流程圖：

 

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rRNA的“高效去除”
        Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)利用RNase H消化法去除人、小鼠、大鼠總RNA中的核糖體RNA。該試劑盒對于完整和部分降解的總RNA（如FFPE RNA）均具有良好的rRNA去除效果。可用于高通量測序分析mRNA和非編碼RNA，也可用于cDNA合成或其它下游應用。
   
圖3：1μg 293T 總RNA 進行 rRNA 去除，利用 qPCR 對比去除前后 rRNA 基因和 mRNA 基因的Ct值變化（左圖）
分別以1μg 人、小鼠、大鼠總RNA為樣本，試劑盒去除rRNA后建庫，測序獲得rRNA殘留%數(shù)據（右圖）

 

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參考文獻：

1. Adiconis X , Borges-Rivera D , Satija R , et al. Corrigendum: Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples[J]. Nature Methods, 2014, 11(2):210-210.
2. Zhao W , He X , Hoadley K A , et al. Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling[J]. Bmc Genomics, 2014, 15(1).
3. Petrova O E , Garcia-Alcalde F , Zampaloni C , et al. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterial biofilm and mixed pathogen culture transcriptomes[J]. Scientific Reports, 2017, 7:41114.