－酵母單/雙雜交研究的篩選標(biāo)記

金擔(dān)子素A (Aureobasidin A，AbA)是從絲狀真菌Aureobasidium pullulans No. R106中分離出來(lái)的環(huán)酯肽類抗生素，具有很強(qiáng)的抗真菌能力，在較低的濃度下(0.1-0.5 μg/mL)即可對(duì)酵母產(chǎn)生毒性。AbA作用機(jī)制是通過(guò)抑制酵母中AUR1基因編碼的肌醇磷酰胺合成酶(inositol phosphorylceramide synthase, IPC synthase)的活性，阻礙神經(jīng)酰胺到肌醇磷酰胺的合成，導(dǎo)致鞘脂類物質(zhì)不足，細(xì)胞膜破裂，從而殺死菌株。對(duì)AbA敏感的的真菌種類包括：出牙酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)和黑曲霉(A. niger.)。

圖1 AbA結(jié)構(gòu)式，CAS#127785-64-2

研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母的AUR1基因與構(gòu)巢曲霉的AURA基因具有同源性，都能編碼IPC合成酶，因此，對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行突變，能夠賦予菌株很強(qiáng)的AbA抗性，比如：突變基因AUR1-C。AbA非常適合作為篩選陽(yáng)性克隆的藥物選擇性標(biāo)記，使用上也不需要優(yōu)化條件，且背景極低。AbA抗性也是酵母單/雙雜交研究中理想的報(bào)告子，兼容于攜帶相應(yīng)抗性的酵母雜交系統(tǒng)。

酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two-hybrid assay)是由Fields和 Song等人根據(jù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點(diǎn)創(chuàng)建的，能夠快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用，在研究抗原和抗體相互作用、發(fā)現(xiàn)新蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能、篩選藥物作用靶點(diǎn)、建立基因組蛋白連鎖圖等方面應(yīng)用廣泛。酵母雙雜交原理是：真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子含有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain，DNA-BD)和DNA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activation domain，AD)，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域可以獨(dú)立分開(kāi)，功能互不影響。BD和AD分別單獨(dú)作用并不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，只有當(dāng)二者在空間上充分接近時(shí)，才呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄激活因子活性，使下游基因得到轉(zhuǎn)錄。將兩待研究蛋白（蛋白X與蛋白Y）分別與BD 、AD結(jié)構(gòu)域構(gòu)建融合質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入同一酵母細(xì)胞中表達(dá)，如果兩蛋白之間不存在相互作用，則報(bào)告基因不會(huì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)；如果兩個(gè)蛋白存在相互作用，則BD與AD兩結(jié)構(gòu)域空間上很接近，從而報(bào)告基因得到轉(zhuǎn)錄。

圖2 酵母雙雜交原理圖^[1]

酵母單雜交技術(shù)是在酵母雙雜基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一種研究核酸-蛋白相互作用的工具，被廣泛用于研究真核細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)調(diào)控，如鑒定已知DNA和已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用；分離結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點(diǎn)的新蛋白質(zhì)；準(zhǔn)確定位已經(jīng)證實(shí)的具有相互作用的DNA結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。它的基本原理是將已知順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動(dòng)子(minimal promoter，Pmin)的上游，把報(bào)告基因連接到Pmin下游。將編碼待測(cè)轉(zhuǎn)錄因子cDNA與酵母AD結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活 Pmin啟動(dòng)子，使報(bào)告基因得到表達(dá)。

圖3 酵母單雜交原理圖^[2]

針對(duì)酵母單/雙雜交研究，翌圣生物推出產(chǎn)品60231ES Aureobasidin A (AbA) 金擔(dān)子素A，是溶于甲醇的AbA溶液，純度 ≥ 97%，濃度為1 mg/mL。翌圣推薦在酵母單/雙雜交實(shí)驗(yàn)中AbA抑制濃度為：100-1000 ng/mL，具體的工作濃度取決于宿主細(xì)胞的敏感度（見(jiàn)表1. AbA對(duì)各種酵母菌的抑菌濃度(MIC)）。

表1 Aureobasidin A對(duì)各種酵母菌抑菌濃度

為研究GmWRKY31蛋白在GmSAGT1基因啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)，在酵母單雜實(shí)驗(yàn)中，將目的DNA序列插入到含有尿嘧啶報(bào)告基因Ura3的pBait-AbAi載體中，位于基因AUR1-C的上游，酵母轉(zhuǎn)化相應(yīng)質(zhì)粒后懸浮在0.9% NaCl溶液中，OD600調(diào)整為0.005。隨后，將100 μL樣品涂于含500 ng/mL AbA的平板上，倒置，30℃下培養(yǎng)3-5天。^[3]

參考文獻(xiàn)

[1] Paiano A, et al. Yeast Two-Hybrid Assay to Identify Interacting Proteins.Curr Protoc Protein Sci. 2019 Feb;95(1):e70.

[2] John S, et al. Yeast one-hybrid assays: a historical and technical perspective.Methods. 2012 August;57(4): 441-447.

[3] Dong H, et al. Transcriptome analysis of soybean WRKY TFs in response to Peronospora manshurica infection. Genomics. 2019 Dec;111(6):1412-1422.