糖尿病(diabetes mellitus, DM)是由多種疾病因素復(fù)合導(dǎo)致的以慢性血糖水平增高為特征的全身慢性代謝性疾病，與家族遺傳、環(huán)境因素以及自身免疫相關(guān)，已成為嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題，其并發(fā)癥不僅嚴(yán)重影響糖尿病患者的生活質(zhì)量，同時也是致殘、致死的重要原因，但其具體的發(fā)病機(jī)制目前尚未*闡明。因此，建立合適的糖尿病動物模型，闡明DM及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制就顯得尤為重要。目前，DM動物模型制備方法主要有：手術(shù)切除胰腺、化學(xué)藥物誘導(dǎo)、自發(fā)性糖尿病動物模型、轉(zhuǎn)基因動物等。

目前，采用較多的是利用Streptozocin鏈脲佐菌素鏈(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病疾病模型，適合長期觀察。STZ是一種含亞硝基的化合物，進(jìn)入體內(nèi)可通過以下機(jī)制特異性地破壞胰島β細(xì)胞：

（1）STZ直接破壞胰島β細(xì)胞：主要見于注射大劑量STZ后。STZ注射后可引起β細(xì)胞內(nèi)輔酶I（NAD）的濃度下降，NAD依賴性能量和蛋白質(zhì)代謝停止，導(dǎo)致β細(xì)胞死亡；

（2）通過誘導(dǎo)一氧化氮(NO)的合成，破壞胰島β細(xì)胞；

（3）STZ激活自身免疫過程，進(jìn)一步導(dǎo)致β細(xì)胞的損害：小劑量注射STZ可破壞少量胰島β細(xì)胞，死亡的胰島β細(xì)胞可作為抗原被巨噬細(xì)胞吞噬，產(chǎn)生TH1刺激因子，使TH1細(xì)胞系占優(yōu)勢而產(chǎn)生IL-2及IFN-γ，在胰島局部促使炎性細(xì)胞浸潤，并活化釋放IL-1、TNF-α、IFN-γ、NO和H₂O₂等物質(zhì)殺傷細(xì)胞。死亡細(xì)胞又可作為自身抗原，再次遞呈給抗原遞呈細(xì)胞進(jìn)行處理，釋放細(xì)胞因子，放大細(xì)胞損傷效應(yīng)，最終誘發(fā)DM。

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1. STZ誘導(dǎo)糖尿病模型的構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)SOP

1.1 動物的準(zhǔn)備

盡量選用雄性動物，雌性含有激素影響建模效率。有研究顯示，雌性動物成模率差，而且可能會比雄性出現(xiàn)更高死亡率，尤其是I型。

I型糖尿病(Type I diabetes) 一般按照體重選擇即可，推薦大鼠170-200g，小鼠17-22g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1~2周后空腹注射STZ，成模率相對理想。

II型糖尿病(Type II diabetes) 對于大鼠（比如SD/Wistar），選取4-5周齡，體重在90-100g，高脂高糖飼料喂養(yǎng)4-6周體重約達(dá)240-280g。對于小鼠（比如C57/ICR/昆明小鼠），選取4-5周齡，體重在16-20g，高脂高糖飼料喂養(yǎng)4-6周體重約達(dá)30-35g。對于新購入動物或更換飼養(yǎng)環(huán)境需要先用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，然后再選擇適合周齡/體重動物轉(zhuǎn)用高脂高糖飼料繼續(xù)喂養(yǎng)。從模型建立成功率來看，大鼠推薦用SD，小鼠推薦C57。
1.2 造模前的喂養(yǎng)

造膜前的喂養(yǎng)，Ⅰ型糖尿病模型成模比較快，通常大鼠在普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后即可開始造模；Ⅱ型糖尿病模型：高脂飲食誘導(dǎo)加小劑量STZ，造模前喂以高脂高糖飼料，誘發(fā)出胰島素抵抗。
1.3 試劑的準(zhǔn)備

①高脂高糖飼料

由基礎(chǔ)鼠飼料加蔗糖、煉豬油和蛋黃按質(zhì)量比搭配制作高脂高糖飼料：其比例為豬油10 %，蔗糖20 %，蛋黃粉10%，膽酸鈉0.5%，基礎(chǔ)飼料59.5%。

②STZ－檸檬酸鈉緩沖液的配制

A液和B液的配制：稱取檸檬酸(MW: 210.14) 2.1 g加入雙蒸水100 mL中配成A液；稱取檸檬酸鈉(MW: 294.10) 2.94 g加入雙蒸水100 mL中配成B液。

檸檬酸鈉緩沖液的配制：將A、B液按一定比例混合（1：1.32或1:1），調(diào)節(jié)pH值到4.2－4.5，用0.22 μm濾膜過濾除菌，即是所需檸檬酸鈉緩沖液，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

稱取STZ凍干粉，放置干燥無菌瓶中，用錫箔紙包好，置于冰上，加入預(yù)冷的檸檬酸鈉緩沖液(1% w/v)溶解，用0.22 μm濾膜過濾除菌。

注意：①STZ凍干粉從?20°C冰箱取出后，室溫干燥避光放置10 min左右，使其*解凍（很重要）。②STZ不穩(wěn)定，易失活，快速稱取后剩余試劑仍要求干燥避光，推薦用干燥鋁箔(或錫箔)紙包裹。③注射時若操作不熟練，切忌不可一次性溶解完STZ。建議根據(jù)操作熟練度，分組溶解STZ，比如10只或15只鼠/組。亦可提前將STZ按動物分組的所需量稱重，分裝。
1.4 注射

按動物空腹體重腹腔或尾靜脈注射，與腹腔注射相比，尾靜脈注射藥物利用效率更高，但操作難度較大。如果注射操作技術(shù)不熟練，應(yīng)兩組交替注射，注射應(yīng)在30 min內(nèi)完畢。

Ⅰ型糖尿病模型：大鼠劑量建議為70～65mg/kg，Ⅱ型糖尿病模型：高糖高脂喂養(yǎng)1～2個月的大鼠，劑量建議在25～40mg/kg。

注意：實驗前應(yīng)進(jìn)行預(yù)實驗，確定合適藥量，因為動物均重、空腹抗藥力、禁食時間、注射手法和飼養(yǎng)過程皆不一樣，不要盲目按照文獻(xiàn)用藥量直接進(jìn)行實驗。

1.5 注射后

注射完STZ后要給予動物足夠的水、食物（糖尿病鼠的基本生活特征），需每日換墊料，保持鼠籠干燥。飼養(yǎng)時，注意避免強(qiáng)日光照射。盡可能勤消毒。

注意：STZ造模后，明顯血糖水平波動呈現(xiàn)3個時相，一時性高血糖(1-2 h)、短暫低血糖(6-10 h)、持續(xù)高血糖(>72 h)。必須適當(dāng)補(bǔ)給胰島素和葡萄糖。

1.6 未達(dá)標(biāo)模型如何補(bǔ)救

模型不達(dá)標(biāo)，在動物穩(wěn)定后補(bǔ)注STZ（以10－20 mg/kg劑量腹腔注射，根據(jù)實際情況選擇合適劑量），或者待血糖恢復(fù)正常后再按常規(guī)劑量注射。但想要達(dá)到理想效果，往往是要恢復(fù)到正常狀態(tài)下重新造模。

2. STZ誘導(dǎo)糖尿病模型建模效果評估指標(biāo)

1、一般性指標(biāo)：出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象，體重下降；

2、其他指標(biāo)：空腹血糖、空腹血清胰島素水平、血清胰島素水平、胰島素敏感性、糖耐量等；

3、血清生化指標(biāo)：T-Cho、TG、HDL-C、LDL-C、CR、BUN、Alt等；

4、病理切片：胰腺組織病理切片；

3. STZ誘導(dǎo)糖尿病模型的失敗的可能原因

1、STZ的品質(zhì)差，建模用STZ純度應(yīng)不低于98%（HPLC檢測）。

2、STZ失效：STZ易潮解，應(yīng)干燥保存，避免受潮。粉末避免長時間室溫放置，溶解的STZ非常不穩(wěn)定，在中性pH值的半衰期為15 min，應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。注意用酸性pH值溶解STZ，最好放在冰浴里。

3、腹腔注射是否注射到腸子等臟器。

模型不達(dá)標(biāo)，建議再觀察3天，若仍不成模型，重新注射一次。

4. STZ誘導(dǎo)小/大鼠死亡率高的原因解析

1、鼠的體重過低；

2、飲水量不足；

3、高血糖和低血糖都會造成鼠死亡，可以通過注射胰島素或暫時補(bǔ)糖降低死亡率：

①常見為血糖過高。補(bǔ)胰島素法，補(bǔ)一些中效胰島素。例如給諾和靈n或NPH(中性魚精蛋白鋅胰島素)，每次2-3個單位，3-5天后大鼠一般死亡率就低了；

②補(bǔ)糖法，禁食后的鼠，注射的時候已經(jīng)處于低血糖狀態(tài)，造模4 h后腹腔注射20%的葡萄糖，可避免因注射時血糖過低死鼠；

4、動物自相殘殺。食物缺乏和供水不足的情況下，會互相撕殺、啃食同類，所以食物和飲水要供應(yīng)充足，最好是兩路供應(yīng);

5、感染。糖尿病大鼠尿量多，墊料潮濕，需要勤換墊料，所以糖尿病大鼠較其他大鼠容易出現(xiàn)感染，特別是泌尿道感染和腹腔感染。腹腔注射、皮下注射及采血測血糖等侵入性操作前后，要注意消毒工作。如每次采血測血糖后可用四環(huán)素(霉素眼藥膏)局部涂抹處理傷口預(yù)防感染。

5. 糖尿病建模的影響因素

糖尿病疾病模型的影響因素包括STZ建模試劑的質(zhì)量、動物狀況及給藥方式等。其中，試劑主要性能為純度、穩(wěn)定性、溶解特性等，動物狀況主要包括遺傳背景，雌雄，性別，體重，飼養(yǎng)環(huán)境，飲食結(jié)構(gòu)等，給藥方式包括給藥時間、給藥間隔和給藥途徑。差異化的因素帶來差異化的建模效果。

6. 高建模成功率STZ使用指南

STZ保存、溶解、分裝等使用注意事項，

相關(guān)產(chǎn)品信息

使用本產(chǎn)品相關(guān)文獻(xiàn):

Xi Z, et al. Dual-modified nanoparticles overcome sequential absorption barriers for oral insulin delivery. J Control Release. 2022 Feb;342:1-13. (PMID: 34864116, IF:7.727)